Dört boyutlu Floresans Görüntüleme ile Sinir Terminalleri Yaşayan endozom Dinamiği Görselleştirme
Summary
Dört boyutlu (4D) görüntüleme omurgalı sinir terminalleri canlı endozomlar iki tip arasındaki davranış ve etkileşimleri incelemek için kullanılmaktadır. Bu küçük yapıların hareketi gibi endozom füzyon ve ekzositoz gibi olayların onay izin, üç boyutlu olarak karakterize edilir.
Abstract
Jartiyer yılan kas abdominis dört boyutlu (4D) görüntüleme hafif ince transversus motor sinir terminalleri içinde küçük yapıların davranışlarını incelemek için kullanılır olmuştur. Ham veri 3D z yığınlarının time-lapse dizileri içerir. Her yığın 400-1,500 nm ayrılmış odak uçakları epifluorışıma optik ile edinilen 4-20 görüntülerini içerir. Bu tür odak ayarı olarak görüntü yığınlarından edinimi adımlar, uyarma dalga boylarında anahtarlama ve dijital kamera operasyon, görüntü oranını maksimize etmek ve ışık maruz kalma doku hasarı en aza indirmek için mümkün olduğunca otomatik vardır. Kazanılmasından sonra, görüntü yığınlarının bir dizi uzamsal çözünürlüğü artırmak için deconvolved edilir, istenen 3D formatına dönüştürülmüş ve bir 4D "film" olduğunu aranan deneysel verilere bağlı olarak, bilgisayar tabanlı analizler çeşitli için uygundur oluşturmak için kullanılır. Bir uygulama sinir terminalleri-macroendosomes bulunan endozomların iki sınıf (MES) dinamik davranış çalışmadırve (AE)-büyüklükleri (her iki tipi için 200-800 nm) asidik endozomlar difraksiyon sınırı ya da yakınında bulunmaktadır. Her zaman noktasında 3D bilgilere erişim geleneksel time-lapse görüntüleme üzerinde çeşitli avantajlar sağlamaktadır. Özellikle de, boyut ve yapıların hareket hızı keskin bir odak kaybı olmaksızın zaman içinde ölçülebilir. 4D görüntüleme veri örnekleri onlar ekzositozlanmış yerine sadece dikey olarak uzak odak tek bir düzlemde hareket ediyor düşündüren, ME'ler plazma zarı yaklaşım ve yok olduğunu ortaya koymaktadır. Aynı zamanda, her üç ortogonal çıkıntılar görüldüğü gibi, iki boya içeren yapılar arasındaki örtüşme ile görselleştirme ME'ler ve AE'lerin varsayılan füzyon olduğunu ortaya çıkardı.
Introduction
Canlı doku Time-lapse görüntüleme zaman içinde tek bir noktada görüntülü sabit veya yaşayan hazırlıkları takdir edilemez dinamik yapı-işlev ilişkilerinin görsel erişim sağlar. Çoğu zaman, ancak, zamansal bilgilere erişim için takas optik çözünürlükte bir azalmadır. Yüksek sayısal açıklık yağ daldırma hedefleri tek alternatif olarak su daldırma veya kuru hedefleri bırakarak, çünkü odak onların dar aralık doku yaşayan pratik değildir. Ayrıca, konfokal optik tarafından sağlanan artan çözünürlük aydınlatma nispeten yüksek seviyelerde 1,2 gereken ikinci fototoksisite nedeniyle bazı oturma terkiplerde kullanılabilir olamaz. Birkaç gerçek zamanlı ya da time-lapse optik teknikleri sunan gelişmiş çözünürlük mevcut iken son olarak, onların uygulanabilirliği ilgi yapıları hedefi 1 birkaç yüz nanometre içine yerleştirilmiş olabilir hazırlıklarına sınırlıdır. Tarif edilen yöntem,, nispeten düşük maliyetli ekipman kullanan çok yönlü, henüz daha yaygın kullanılan time-lapse teknikleri ile karşılaştırıldığında geliştirilmiş çözünürlük sunuyor. Bu, her laboratuvar hem de görüntüleme tesislerde kullanım için tasarlanmıştır.
Yöntem, bir hassas dijital kamera ile ve hızlı bir şekilde biraz farklı odak düzlemleri (z-yığınları) de görüntülerin setleri elde etmek için tasarlanmış donanım ile birlikte, geleneksel epifloresans mikroskobu kullanır. Her z-yığın dijital çözünürlüğü artırmak için deconvolved edilir. 3D time-lapse (4D) görüntüleme bir özelliği organellere veya diğer yapıların hareketli hassas takip olduğunu. Düzgün kurduğunuzda, görüntülü yapılar odak dışarı çıkmayın ve her üç yönde hareketi gözlenen ve sayısal olabilir. Lekeli bir yapı sadece dar bir odak düzlemi üzerinde veya altında sürüklenen bir veya daha fazla zaman atlamalı çerçeveleri içinde kaybolur için Böylece imkansızdır. Yöntem, aynı zamanda olası etkileşimleri ve fu değerlendirmek için hassas bir araç olarak hizmet vermektedirKüçük yapılarda sion. Konvansiyonel epifluorışıma veya kırınım sınırı (birkaç yüz nm) yakın yapıların konfokal görüntüleri birleştirilmiş görüntüleri kendi etiketleri 3 çakışmasını göstermek bile füzyon onaylamak değildir. Füzyon önerilen, ancak bu nesnelerin kırınım sınırın altında olan bir mesafe ile yatay veya dikey olarak ayrılır mümkün kalır. Üç ya da dört-boyutlu görüntüleme, aksine, üç ortogonal yönün her birindeki nesnelerin görüntüleme izin verir. Üç görüş füzyon görünümü kesinlik düzeyini arttırır. Ve bazı yaşam hazırlıklar, yönettiği ya da her iki etiket zaman birlikte hareket zaman varsayımsal kaynaşmış nesnelerin Brown hareketi başka kanıtı sağlar. Tabii ki, zaman kırılma sınırına yakın kökenli seçici yapılarda kesinlik veya iki boyalar (füzyon) içerdiğini gösteren düzeyi, mutlak değildir. Eğer böyle bir flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) uygulanabilir, özel teknikler,4, daha uygundur.
Protocol
Representative Results
Discussion
4D görüntüleme en kritik yönü, ışığa maruziyet süresi ve yoğunluğu yönetimi. Photobleaching görüntü sinyal-gürültü oranı azalır ve Flüoroforlann seçimi dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlı olarak sorunlu olabilir ya da olmayabilir. Canlı doku (fototoksisite) için spesifik olmayan zarar ışıkla ağartma ile ilgilidir, ve bazen amaç için 2,12 ya da diferansiyel girişim kontrast (DIC) gibi uygun optik aydınlık ile morfolojisinin incelenmesi ile tasarlanmış fluoresan …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Sağlık Hibe NS-024572 (RSW için) ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents: | |||
| SGC5 | Biotium [Hayward, CA] | 70057 | Final conc:10 mM |
| FM1-43FX | Invitrogen [Carlsbad, CA] | F35335 | Final conc:7 mM |
| LysoTracker Red | Invitrogen [Carlsbad, CA] | L7528 | Final conc:0.2 mM |
| Solutions: | |||
| Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2.5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High KCL Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 86 mM | ||
| KCl | 60 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High Sucrose Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2. 5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| Sucrose | 0.5 M (17.1 gm/50 mL) | ||
| Equipment: | |||
| Name | Company | Comments | Comments(website) |
| Axioplan 200 inverted microscope | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | www.zeiss.com | |
| N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4mm | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | www.zeiss.com | |
| DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher | Sutter instruments [Novato, CA] | 175W Xenon arc lamp | www.sutter.com |
| Lambda 10-2 emission filterwheel switcher | Sutter instruments [Novato, CA] | www.sutter.com | |
| Sensicam CCD camera | Cooke Instruments [Tonawanda, NY] | www.cookecorp.com | |
| Cascade 512 CCD camera | Photometrics [Tucson, AZ] | www.photometrics.com | |
| Imaging dishes- made in-house-11cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins | |||
| Software: | |||
| Name | Company | Comments | Comments(website) |
| Slidebook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations [Denver, CO] | Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation | www.intelligent-imaging.com |
| IMARIS 7.5.2 | Bitplane [South Windsor, CT] | Drift correction; 3D and 4D data presentation | www.bitplane.com |
| AfterEffects CS6 | Adobe [San Jose, CA] | Drift correction | www.adobe.com |
| ImageJ 1.46 | National Institutes of Health [Bethesda, MD] | Multiple plugins available;Stereo pair construction | http://rsbweb.nih.gov/ij |
| Zeiss LSM | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | Stereo pair construction | www.zeiss.com |
Referências
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy-tips and tools. J. Cell Sci. 122 (6), 753-767 (2009).
- Tinevez, J. -. Y., et al. A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope. Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).
- Snapp, E. L., Hegde, R. S. Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells. Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).
- Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. Late” macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals. J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).
- Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons. J. Physiol. 582, 243-262 (2007).
- McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19, 373-385 (1999).
- Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).
- Cromey, D. W., Taatjes, D. J., Roth, J. Digital images are data: and should be treated as such. Methods Mol. Biol. 931, 1-27 (2013).
- Teng, H., Wilkinson, R. S. Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals. J. Neurosci. 20 (21), 7986-7993 (2000).
- Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals. J. Neurosci. 19 (12), 4855-4866 (1999).
- Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L., Mendez-Vilas, A., Diaz, J. Challenges and recent advances in live cell bioimaging. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. , 1495-1505 (2010).
- Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software. J. Vis. Exp. (49), (2011).
