היווצרות של microarrays Biomembrane עם שיטת הרכבה מבוססת מגב
Summary
bilayers שומנים נתמך וחלקיקי קרום טבעיים הם מערכות נוחים שיכול להתקרב למאפיינים של קרום תא ולהיות משולבות במגוון רחב של אסטרטגיות אנליטיות. כאן אנו מדגימים שיטה להכנת microarrays המורכב של SiO 2 חרוזים נתמכים שומנים מצופים bilayer, שלפוחית פוספוליפידים או חלקיקי קרום טבעיים.
Abstract
קרומי bilayer שומנים מהווים את קרום הפלזמה של תאים ולהגדיר את הגבולות של אברונים subcellular. בטבע, קרומים אלה תערובות הטרוגנית של סוגים רבים של שומנים, מכילים חלבוני קרום הנכנס ומעוצבים עם פחמימות. בניסויים מסוימים, רצוי לנתק את מאפייני biophysical או ביוכימי של bilayer שומנים מאלה של הקרום הטבעי. מקרים כאלה קוראים לשימוש במערכות מודל כגון שלפוחית ענקית, ליפוזומים או bilayers נתמכת שומנים (SLBs). מערכים של SLBs הם אטרקטיביים במיוחד ליישומי חישה ומחק תאי תאי אינטראקציות. כאן אנו מתארים שיטה חדשה ליצירת מערכי SLB. 2 חרוזים SiO submicron בקוטר הם מצופים ראשון עם bilayers שומנים ליצירת SLBs הכדורי (SSLBs). אז חרוזים מופקדים לתוך מערך של microwells submicron בקוטר מפוברק מיקרו. טכניקת ההכנה משתמשת "מגב" כדי לנקות את שטח המצע, בעוד leavinגרם מאחורי SSLBs שהתמקם microwells. שיטה זו לא דורשת שינוי כימי של מצע microwell, ולא כל ligands מיקוד מיוחד על SSLB. Microwells תפוס על ידי חרוזים בודדים בגלל הקוטר גם הוא מכוון להיות גדול יותר מקוטר חרוז. בדרך כלל, יותר 75% מהבארות שנכבשו, ואילו השאר יישאר ריק. במאגר מערכי SSLB להציג יציבות לטווח הארוך של יותר משבוע אחד. סוגים שונים של SSLBs יכולים להיות ממוקמים במערך יחיד בתצהיר סדרתי, והמערכים יכולים לשמש לחישה, שאנחנו מדגימים על ידי המאפיינים את האינטראקציה של רעלן הכולרה עם ganglioside GM1. כמו כן, אנו מראים כי שלפוחית פוספוליפידים ללא תומך חרוז וbiomembranes ממקורות סלולריים יכולה להיות מסודרת עם באותה השיטה וניתן לזהות שומני קרום תא ספציפי.
Introduction
קרומי bilayer שומנים הם מבנים חיוניים בטבע. ממברנות פלזמה נייד וקרומים אברון מורכבים מbilayers שומנים המשלבים מספר המולקולות שאינן הכרחיים לחיים. תהליכי חיים מקיימים רבים מתרחשים על פני השטח של תאים או מתווכים על ידי מולקולות הקשורות לממברנות שומנים בדם bilayer. למעשה, תהליכים רבים תרופות יעד או מולקולות נמצאים על או בקרומי 1,2. לכן, יש לחקור בצורה אנליטית תהליכים, כגון תגובות כימיות או אירועים המחייבים noncovalent המתרחשים על פני שטח של קרום. מכיוון שקרומים טבעיים יכולים להיות קשים לבודד ו / או ממשק עם חיישנים, חוקרים רבים להעסיק ממברנות מודל פשוטות לבצע מחקרים אנליטיים. מספר מערכות קרום מודל מתוארים בספרות, החל משלפוחית ענקית שיכולים להיות עשרות עד מאות מיקרונים בקוטר ליפוזומים עם ממדים ננומטריים 3,4. Alternatively, bilayers שומנים מישוריים שהופקד על תמיכה מוצקה, כלומר, נתמך bilayers שומנים (SLBs), יכול להיווצר במספר המשטחים השונים והיה בשימוש נרחב ביישומי biophysical, ביוכימיות, ואנליטיות 5. צימוד SLBs עם חומרים חשמליים או אופטיים מאפשר חקירה לביוכימיה וביופיסיקה קרום באמצעות השימוש בטכניקות אנליטיות שונות. מיקרוסקופ פלואורסצנטי 6, אלקטרוכימיה 7, ספקטרוסקופיה אופטית 8, בדיקה סריקה מיקרוסקופית 9, plasmon משטח התהודה 10, וספקטרומטריית מסת 11 כולם הועסקו כדי לחקור את המבנה והמאפיינים של SLBs.
מערכי SLB להציע צדדיות נוספת בעיצוב של חיישנים עבור מבחני זמנית 12,13. יישומים אחרים להשתמש במערכי SLB לחקות את הצומת שיוצרת בין תאים חיסוניים 14. שיטות הכנה למערכי SLB השתנו מmicrofluidic גישות 15 לאלה שמעסיקים מחסומים פיזיים בין טלאי SLB הסמוכים. 16 קבוצות אחרות השתמשו בשיטות הדפסה 17, דפוסים פוטו 18 וnanoengineering השונות גישות 19 ליצור מערכי SLB.
במאמר זה ובוידאו המצורף אנו מדגימים שיטה ליצירת מערכי SLB ידי הפקדת SiO 2 חרוזים מצופים SLB למערכים מסודרים של microwells 20. אנו מתייחסים לSiO 2 חרוזים מצופים SLB כbilayers הכדורית נתמכת שומנים (SSLBs). טכניקה זו היא הרחבה של עבודה קודמת שיצרו מערכים של שלפוחית פוספוליפידים וbiomembranes נגזר ממקורות טבעיים 21, שממנו אנחנו גם להראות תוצאות ירושלים. שיטות אחרות לעריכת חלקיקי biomembrane או שלפוחית יש לסמוך על דפוסים של ligands מיקוד הספציפי על משטחים שמקשרים עם ligands המשלים הכיל על פני השטח של השלפוחית. דוגמאות כוללות יוטיןעמותת avidin 22,23 וערכות הכלאת DNA 24. הגישה שלנו דורשת רק מערך microwell ללא moieties מיקוד או הכרה הכרחי. הגודל של SSLBs מוגדר על ידי הקוטר של תומך חרוז SiO 2, שיש לי poly-dispersity נמוך. על ידי כוונון קוטר microwell רק גדול יותר מאשר קוטר SSLB, רק SSLB אחת ישקע לתוך כל microwell. מגב פולי (dimethylsiloxane) (PDMS) ואז מסיר מעל פני השטח כל SSLBs שאינם משותקים בmicrowells. יש לי microwells ומערכי SSLB תוצאת צפיפות גבוהה (~ 10 5 SSLBs / 2 מ"מ) עם 3 מיקרומטר מרווח ומחזוריות משושה מרכז למרכז. באופן סדרתי הפקדת SSLBs עם קומפוזיציות שומנים שונות, אפשר ליצור מערכי multicomponent עם SSLBs ממוקם באופן אקראי. כדי להדגים את יכולת החישה של מערכי SSLB, השתמשנו באינטראקציה של רעלן הכולרה (CTX) עם ganglioside (GM1) שולב SSLBs. עםחלקיקי קרום טבעיים, שהיינו מסוגלים לזהות שומני תא ספציפי במערכי multicomponent מכילים חומר קרום משני סוגי תאים שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעבודה זו אנו מראים כי SiO 2 חרוזים monodisperse מצופים bilayers שומנים נתמכים ניתן ערוכים למערכי microwell ללא צורך במיקוד ligands על bilayers השומנים או פני המצע, והמערכים יכולים לשמש לאפיון אינטראקציות רעלן שומנים בדם. אנו קבועים דיסוציאציה שמחושבים לCTx/GM1 מחייב משווה לטובה, בהתחשב …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים לSHO מן המכונים הלאומיים לבריאות (R01 GM092993), הקרן הלאומית למדע (NSF פרס הקריירה וDBI 0,964,216), משרד מחקר של צי (ONR) צעיר תכנית החוקר ופרס מינסוטה השותפות לביוטכנולוגיה וג'נומיקס הרפואי. ייצור מכשיר בוצע במרכז אוניברסיטת מינסוטה Nanofabrication (NFC), שזוכה לתמיכה מNSF דרך רשת ננוטכנולוגיה התשתיות הלאומית. עבודה זו נתמכה גם על ידי מענקים למר מהמכונים הלאומיים לבריאות (NS048357, R21 NS073684), יסודות האגודה הלאומית הטרשת הנפוצה (CA1060A11), אפלבאום, הילטון, פיטרסון וסנפורד ומשפחת McNeilus. המחברים מבקשים להודות Hyungsoon Im לסיוע עם איורים וShailabh קומאר לקבלת סיוע במיקרוסקופיית אלקטרונים.
Materials
| 4-inch silicon wafers | University Wafer | 425 | |
| Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist | MicroChem | SPR955-CM | |
| Shipley MICROPOSIT CD-26 developer | MicroChem | CD-26 | |
| i-line stepper | Canon | 2500 i3 stepper | |
| Vision 320 reactive ion etcher | Advanced Vacuum | Vision 320 RIE | |
| Deep trench reactive ion etcher | Plasma Therm | SLR-770 | |
| Atomic layer depostion system | Cambridge NanoTech | Savannah | |
| Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| egg phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt | Avanti Polar Lipids | 810158C | |
| monosialoganglioside GM1 | Avanti Polar Lipids | 860065P | |
| Silica beads | Bangs Laboratories | SS03N/4666 | Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter. |
| Cholera toxin B-subunit, Alexa 488 conjugate | Molecular Probes | C-34775 | |
| Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate | R&D Systems | NL1326R | |
| FM1-43 | Molecular Probes | T-3136 | |
| Eppendorf MiniSpin centrifuge | Fisher Scientific | 05-401-09 |
Referências
- Drews, J. Drug discovery: A Historical Perspective. Science. 287 (5460), 1960-1964 (1126).
- Cooper, M. A. Advances in Membrane Receptor Screening and Analysis. J. Mol. Recognit. 17 (4), 286-315 (2004).
- Voskuhl, J., Ravoo, B. J. Molecular Recognition of Bilayer Besicles. Chem. Soc. Rev. 38 (2), 495-505 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (1002).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid Supported Lipid Bilayers: From Biophysical Studies to Sensor Design. Surf. Sci. Rep. 61 (10), 429-444 (2006).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early Steps of Supported Bilayer Formation Probed by Single Vesicle Fluorescence Assays. Biophys. J. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Krysinski, P., Zebrowska, A., Michota, A., Bukowska, J., Becucci, L., Moncelli, M. R. Tethered Mono- and Bilayer Lipid Membranes on Au and Hg. Langmuir. 17 (13), 3852-3857 (2001).
- Li, L., Wang, H. F., Cheng, J. X. Quantitative Coherent anti-Stokes Raman Scattering Imaging of Lipid Distribution in Coexisting Domains. Biophys. J. 89 (5), 3480-3490 (2005).
- Richter, R. P., Brisson, A. R. Following the Formation of Supported Lipid Bilayers on Mica: A Study Combining AFM, QCM-D, and Ellipsometry. Biophys. J. 88 (5), 3422-3433 (2005).
- Dahlin, A., Zäch, M., Rindzevicius, T., Käll, M., Sutherland, D. S., Höök, F. Localized Surface Plasmon Resonance Sensing of Lipid-Membrane-Mediated Biorecognition Events. J. Am. Chem. Soc. 127 (14), 5043-5048 (2005).
- Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase Separation of Lipid Membranes Analyzed with High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry. Science. 313 (5795), 1948-1951 (2006).
- Groves, J. T., Boxer, S. G. Micropattern Formation in Supported Lipid Membranes. Acc. Chem. Res. 35 (3), 149-157 (2002).
- Bally, M., Bailey, K., Sugihara, K., Grieshaber, D., Vörös, J., Stadler, B. Liposome and Lipid Bilayer Arrays Towards Biosensing Applications. Small. 6 (22), 2481-2497 (2010).
- Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported Planar Bilayers in Studies on Immune Cell Adhesion and Communication. J. Immunol. Methods. 278 (1-2), 19-32 .
- Yang, T. L., Jung, S. Y., Mao, H. B., Cremer, P. S. Fabrication of Phospholipid Bilayer-Coated Microchannels for On-Chip Immunoassays. Anal. Chem. 73 (2), 165-169 (2001).
- Groves, J. T., Ulman, N., Boxer, S. G. Micropatterning Fluid Lipid Bilayers on Solid Supports. Science. 275 (5300), 651-653 (1997).
- Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning and Composition Arrays of Supported Lipid Bilayers by Microcontact Printing. Langmuir. 17 (11), 3400-3405 (2001).
- Yee, C. K., Amweg, M. L., Parikh, A. N. Direct Photochemical Patterning and Refunctionalization of Supported Phospholipid Bilayers. J. Am. Chem. Soc. 126 (43), 13962-13972 (2004).
- Kelly, C. V., Craighead, H. G. Nanofabrication for the Analysis and Manipulation of Membranes. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1356-1366 (2012).
- Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Oh, S. H. High-Density Arrays of Submicron Spherical Supported Lipid Bilayers. Anal. Chem. 84 (19), 8207-8213 (2012).
- Wittenberg, N. J., et al. Facile Assembly of Micro- and Nanoarrays for Sensing with Natural Cell Membranes. ACS Nano. 5 (9), 7555-7564 (2011).
- Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (45), 5580-5583 (2003).
- Kalyankar, N. D., et al. Arraying of Intact Liposomes into Chemically Functionalized Microwells. Langmuir. 22 (12), 5403-5411 (2006).
- Dahlin, A. B., Jonsson, M. P., Höök, F. Specific Self-Assembly of Single Lipid Vesicles in Nanoplasmonic Apertures in Gold. Adv. Mater. 20 (8), 1436-1442 (2008).
- Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using Patterned Supported Lipid Membranes to Investigate the Role of Receptor Organization in Intercellular Signaling. Nat. Protoc. 6 (4), 523-539 (2011).
- Kuziemko, G. M., Stroh, M., Stevens, R. C. Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Gangliosides Determined by Surface Plasmon Resonance. Bioquímica. 35 (20), 6375-6384 (1996).
- Moran-Mirabal, J. M., Edel, J. B., Meyer, G. D., Throckmorton, D., Singh, A. K., Craighead, H. G. Micrometer-Sized Supported Lipid Bilayer Arrays for Bacterial Toxin Binding Studies Through Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Biophys. J. 89 (1), 296-305 (2005).
- Shi, J. J., Yang, T. L., Kataoka, S., Zhang, Y. J., Diaz, A. J., Cremer, P. S. GM1 Clustering Inhibits Cholera Toxin Binding in Supported Phospholipid Membranes. J. Am. Chem. Soc. 129 (18), 5954-5961 (2007).
- Gill, D. M. The Arrangement of Subunits in Cholera Toxin. Bioquímica. 15 (6), 1242-1248 (1021).
- Weng, K. C., Kanter, J. L., Robinson, W. H., Frank, C. W. Fluid Supported Lipid Bilayers Containing Monosialoganglioside GM1: A QCM-D and FRAP study. Colloid Surface B. 50 (1), 76-84 (1016).
- Walt, D. R. Fibre Optic Microarrays. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 38-50 (2010).
- Bake, K. D., Walt, D. R. Multiplexed Spectroscopic Detections. Annu. Rev. Anal. Chem. 1 (1), 515-547 (2008).
- Kundu, J., Levin, C. S., Halas, N. J. Real-Time Monitoring of Lipid Transfer Between Vesicles and Hybrid Bilayers on Au Nanoshells Using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS). Nanoscale. 1 (1), 114-117 (2009).
- Junesch, J., Sannomiya, T., Dahlin, A. B. Optical Properties of Nanohole Arrays in Metal-Dielectric Double Films Prepared by Mask-on-Metal Colloidal Lithography. ACS Nano. 6 (11), 10405-10415 (2012).
- Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).
- Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).
- Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads. J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).
