Formación de biomembrana Microarrays con un método basado en la Asamblea Rasero
Summary
Bicapas lipídicas soportadas y partículas de membrana naturales son sistemas convenientes que pueden aproximarse a las propiedades de las membranas celulares y ser incorporadas en una gran variedad de estrategias de análisis. Aquí se demuestra un método para preparar compuestos de microarrays de soportados de lípidos de la bicapa recubiertos de SiO 2 perlas, vesículas de fosfolípidos o partículas de membrana naturales.
Abstract
Membranas de bicapa lipídica forman las membranas plasmáticas de las células y definen los límites de orgánulos subcelulares. En la naturaleza, estas membranas son mezclas heterogéneas de muchos tipos de lípidos, contienen proteínas unidas a membrana y están decoradas con hidratos de carbono. En algunos experimentos, es deseable desacoplar las propiedades biofísicas o bioquímicas de la bicapa lipídica de las de la membrana natural. Tales casos requieren el uso de sistemas modelo tales como vesículas gigantes, liposomas o bicapas lipídicas soportadas (SLBS). Las matrices de SLBS son particularmente atractivos para aplicaciones de detección y imitando las interacciones célula-célula. Aquí se describe un nuevo método para la formación de matrices de SLB. Submicron de diámetro SiO 2 perlas se recubrieron primero con bicapas de lípidos para formar SLBS esféricas (SSLBs). Las perlas se depositan en una matriz de pocillos de micro-fabricada submicrónica de diámetro. La técnica de preparación utiliza un "escobilla de goma" para limpiar la superficie del sustrato, mientras que Leaving detrás SSLBs que se han asentado en los micropocillos. Este método no requiere ninguna modificación química del sustrato de micropocillos, ni ningún ligandos de dirección particulares sobre el SSLB. Los micropocillos están ocupados por perlas individuales debido a que el diámetro del pozo está sintonizado para ser justo más grande que el diámetro de la perla. Por lo general, más del 75% de los pozos están ocupadas, mientras que el resto permanece vacía. En búfer arrays SSLB muestran estabilidad a largo plazo de más de una semana. Múltiples tipos de SSLBs se pueden colocar en una sola matriz por deposición de serie, y las matrices se pueden utilizar para la detección, lo que se demuestra mediante la caracterización de la interacción de la toxina del cólera con el gangliósido GM1. También ponen de manifiesto que las vesículas de fosfolípidos sin los soportes de cuentas y biomembranas de fuentes celulares pueden ser dispuestos con el mismo método y los lípidos de membrana específicos de células se pueden identificar.
Introduction
Membranas de bicapa lipídica son estructuras esenciales en la naturaleza. Membranas plasmáticas celulares y membranas de orgánulos están compuestas de bicapas de lípidos que incorporan una serie de moléculas que son necesarias para la vida. Muchos de los procesos que mantienen la vida ocurren en la superficie de las células o están mediadas por moléculas asociadas con membranas bicapa lipídica. De hecho, muchos productos farmacéuticos procesos diana o moléculas se encuentran sobre o en las membranas de 1,2. Por lo tanto, es necesario investigar analíticamente procesos, tales como reacciones químicas o acontecimientos de unión no covalentes que se producen en las superficies de membrana. Debido a que las membranas naturales pueden ser difíciles de aislar y / o de la interfaz con sensores, muchos investigadores emplean membranas modelo simplificado para llevar a cabo estudios analíticos. Un número de sistemas de membrana modelo se describen en la literatura, que van desde las vesículas gigantes que pueden ser decenas a cientos de micrómetros de diámetro a liposomas con dimensiones nanométricas 3,4. Alterntivamente, bicapas lipídicas planas depositados sobre soportes sólidos, es decir, soportadas bicapas de lípidos (SLBS), se pueden formar en un número de diferentes superficies y han sido ampliamente utilizados en aplicaciones biofísicas, bioquímicas, y de análisis 5. Acoplamiento SLBS con materiales eléctricos u ópticos permite la investigación de la bioquímica y biofísica de la membrana a través de la utilización de diferentes técnicas analíticas. La microscopía de fluorescencia 6, la electroquímica 7, 8 espectroscopia óptica, microscopía de sonda 9, resonancia de plasmón superficial 10, y espectrometría de masas 11 han sido empleados para estudiar la estructura y propiedades de SLBS.
Matrices SLB ofrecen versatilidad adicional en el diseño de sensores para ensayos multiplex 12,13. Otras aplicaciones utilizan arrays SLB para imitar la unión que se forma entre las células inmunes 14. Métodos de preparación de matrices SLB han variado de microfluidic se acerca 15 de las que emplean las barreras físicas entre parches SLB adyacentes. 16 Otros grupos han utilizado métodos de impresión 17, 18 patrones fotoquímica y diversos enfoques nanoingeniería 19 para crear matrices SLB.
En este artículo y el video adjunto se demuestra un método para formar matrices SLB depositando recubiertos-SLB SiO 2 cuentas en conjuntos ordenados de micropocillos 20. Nos referimos a los recubiertos de SLB SiO 2 cuentas como bicapas lipídicas soportadas esféricas (SSLBs). Esta técnica es una extensión del trabajo anterior que crea matrices de vesículas de fosfolípidos y biomembranas derivados de fuentes naturales 21, de donde también muestran ejemplos de resultados. Otros métodos para formar clusters de partículas de biomembrana o vesículas se han basado en los patrones de ligandos de direccionamiento específicos en las superficies que se asocian con ligandos complementarios contenidos en la superficie de la vesícula. Ejemplos incluyen biotina-asociación avidina 22,23 y esquemas de hibridación de ADN 24. Nuestro enfoque sólo requiere una matriz de micropocillos sin restos necesarias de orientación o de reconocimiento. El tamaño de SSLBs se define por el diámetro de los soportes de SiO 2 de talón, que tienen baja polidispersidad. Al ajustar el diámetro de micropocillos a sólo mayor que el diámetro SSLB, sólo un único SSLB se asienta en cada micropocillo. Un poli (dimetilsiloxano) (PDMS) de rasqueta retira entonces de la superficie de todos los SSLBs que no están inmovilizados en micropocillos. Los micropocillos y matrices SSLB resultantes tienen alta densidad (~ 10 5 SSLBs / mm 2) con 3 micras separación de centro a centro y periodicidad hexagonal. Al depositar en serie SSLBs con diferentes composiciones de lípidos, es posible crear matrices de múltiples componentes con SSLBs posicionado al azar. Para demostrar la capacidad de detección de matrices SSLB, hemos utilizado la interacción de la toxina del cólera (CTx) con un gangliósido (GM1) incorporado en los SSLBs. Conpartículas de membrana naturales, hemos sido capaces de detectar los lípidos específicos de células en matrices de múltiples componentes que contienen material de la membrana a partir de dos tipos de células diferentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este trabajo se muestra que monodispersas de SiO 2 perlas recubiertas con bicapas lipídicas soportadas pueden ser dispuestos en matrices de micropocillos sin la necesidad de ligandos en las bicapas lipídicas o la superficie del sustrato, y las matrices se pueden utilizar para la caracterización de interacciones lípido-toxina. La constante de disociación hemos calculado para CTx/GM1 vinculante se compara favorablemente, dada la gran disparidad de los valores en la literatura, con un informe anterior po…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas de SHO de los Institutos Nacionales de Salud (R01 GM092993), la Fundación Nacional de Ciencia (NSF premio CARRERA y DBI 0964216), la Oficina de Investigación Naval (ONR) Programa de Jóvenes Investigadores y el Premio de la Asociación de Minnesota de Biotecnología y Genómica Médicos. La fabricación del dispositivo se realizó en la Universidad de Minnesota Nanofabrication Center (NFC), que recibe el apoyo de la NSF a través de la Red de Infraestructura Nacional de Nanotecnología. Este trabajo también fue apoyado por becas a MR de los Institutos Nacionales de Salud (NS048357, R21 NS073684), la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple (CA1060A11), el Applebaum, Hilton, Peterson y Sanford Fundaciones y la familia McNeilus. Los autores desean agradecer a Hyungsoon Im para obtener ayuda con las ilustraciones y Shailabh Kumar de asistencia con microscopía electrónica de barrido.
Materials
| 4-inch silicon wafers | University Wafer | 425 | |
| Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist | MicroChem | SPR955-CM | |
| Shipley MICROPOSIT CD-26 developer | MicroChem | CD-26 | |
| i-line stepper | Canon | 2500 i3 stepper | |
| Vision 320 reactive ion etcher | Advanced Vacuum | Vision 320 RIE | |
| Deep trench reactive ion etcher | Plasma Therm | SLR-770 | |
| Atomic layer depostion system | Cambridge NanoTech | Savannah | |
| Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| egg phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt | Avanti Polar Lipids | 810158C | |
| monosialoganglioside GM1 | Avanti Polar Lipids | 860065P | |
| Silica beads | Bangs Laboratories | SS03N/4666 | Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter. |
| Cholera toxin B-subunit, Alexa 488 conjugate | Molecular Probes | C-34775 | |
| Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate | R&D Systems | NL1326R | |
| FM1-43 | Molecular Probes | T-3136 | |
| Eppendorf MiniSpin centrifuge | Fisher Scientific | 05-401-09 |
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