एक squeegee आधारित विधानसभा विधि के साथ Biomembrane डीएनए की संरचना
Summary
समर्थित लिपिड bilayers और प्राकृतिक झिल्ली कणों कोशिका झिल्ली के गुण अनुमानित कर सकते हैं और विश्लेषणात्मक रणनीतियों की एक किस्म में शामिल किया है कि सुविधाजनक व्यवस्था कर रहे हैं. यहाँ हम समर्थित लिपिड bilayer में लिपटे 2 Sio मोती, फॉस्फोलिपिड पुटिका या प्राकृतिक झिल्ली कणों से बना प्रोटीन की तैयारी के लिए एक विधि का प्रदर्शन.
Abstract
लिपिड bilayer झिल्ली कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली और subcellular organelles की सीमाओं को परिभाषित. प्रकृति में, इन झिल्ली, लिपिड के कई प्रकार की विषम मिश्रण हैं झिल्ली ही सीमित प्रोटीन होते हैं और कार्बोहाइड्रेट से सजाया जाता है. कुछ प्रयोगों में, यह प्राकृतिक झिल्ली के उन लोगों से लिपिड bilayer की biophysical या जैव रासायनिक गुणों दसगुणा करने के लिए वांछनीय है. इस तरह के मामलों में इस तरह के विशाल पुटिका, liposomes या समर्थित लिपिड bilayers (SLBs) के रूप में मॉडल प्रणाली के उपयोग के लिए कहते हैं. SLBs की सारणियों अनुप्रयोगों संवेदन और सेल सेल बातचीत की नकल उतार के लिए विशेष रूप से आकर्षक हैं. यहाँ हम SLB सरणियों के गठन के लिए एक नई विधि का वर्णन. Submicron व्यास 2 Sio मोती पहले गोलाकार SLBs (SSLBs) के रूप में लिपिड bilayers साथ लेपित हैं. माला तो सूक्ष्म गढ़े submicron व्यास microwells की एक सरणी में जमा कर रहे हैं. leavin जबकि तैयारी तकनीक, सब्सट्रेट सतह को साफ करने के लिए एक "squeegee" का उपयोग करता हैmicrowells में तय हो चुका है कि SSLBs पीछे छ. इस विधि microwell सब्सट्रेट का कोई रासायनिक परिवर्तन, और न ही SSLB पर किसी विशेष को निशाना बनाने ligands की आवश्यकता है. अच्छी तरह से व्यास मनका व्यास की तुलना में अभी भी बड़ा होना देखते है क्योंकि microwells एकल मोती के कब्जे में हैं. बाकी खाली रहते हैं, जबकि आमतौर पर, कुओं की अधिक 75%, कब्जा कर रहे हैं. बफर में SSLB सरणियों एक से अधिक सप्ताह के दीर्घकालिक स्थिरता प्रदर्शित करते हैं. हम ganglioside GM1 साथ हैजा विष की बातचीत निस्र्पक द्वारा प्रदर्शित करता है, जो SSLBs के कई प्रकार के धारावाहिक बयान से एक एकल सरणी में रखा जा सकता है, और सरणियों संवेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम भी सेलुलर स्रोतों से मनका का समर्थन करता है और biomembranes बिना फॉस्फोलिपिड पुटिका एक ही विधि के साथ arrayed जा सकता है और सेल विशिष्ट झिल्ली लिपिड पहचाना जा सकता है.
Introduction
लिपिड bilayer झिल्ली प्रकृति में आवश्यक संरचनाओं हैं. सेलुलर प्लाज्मा झिल्ली और organelle झिल्ली जीवन के लिए आवश्यक हैं कि अणुओं की एक संख्या शामिल है कि लिपिड bilayers से बना रहे हैं. कई जीवन बनाए रखने प्रक्रियाओं कोशिकाओं की सतह पर होते हैं या लिपिड bilayer झिल्ली के साथ जुड़े अणुओं द्वारा मध्यस्थता कर रहे हैं. वास्तव में, कई दवाइयों लक्ष्य प्रक्रियाओं या अणुओं 1,2 पर या झिल्ली में पाया जाता है. यह विश्लेषणात्मक ऐसी झिल्ली सतहों पर होने वाले रासायनिक प्रतिक्रियाओं या noncovalent बंधन घटनाओं के रूप में प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए आवश्यक है. प्राकृतिक झिल्ली सेंसर के साथ अलग और / या इंटरफेस के लिए मुश्किल हो सकता है, क्योंकि कई शोधकर्ताओं विश्लेषणात्मक अध्ययन से बाहर ले जाने के लिए सरल मॉडल झिल्ली को रोजगार. मॉडल झिल्ली प्रणालियों के एक नंबर nanoscale आयाम 3,4 के साथ liposomes के लिए व्यास में microns के सैकड़ों के दसियों हो सकता है कि विशाल vesicles से लेकर साहित्य में वर्णित हैं. Alternatively, ठोस समर्थन पर जमा तलीय लिपिड bilayers, यानी, लिपिड bilayers (SLBs), विभिन्न सतहों के एक नंबर पर गठित किया जा सकता है और व्यापक रूप से biophysical जैव रासायनिक, और विश्लेषणात्मक अनुप्रयोगों 5 में इस्तेमाल किया गया है का समर्थन किया. बिजली या ऑप्टिकल सामग्री के साथ SLBs युग्मन विभिन्न विश्लेषणात्मक तकनीकों के उपयोग के माध्यम से झिल्ली जैव रसायन और बायोफिज़िक्स की जांच में सक्षम बनाता है. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 6, Electrochemistry 7, ऑप्टिकल स्पेक्ट्रोस्कोपी 8, स्कैनिंग जांच माइक्रोस्कोपी 9, सतह plasmon अनुनाद 10, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री 11 सब SLBs की संरचना और गुणों का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है.
SLB सरणियों मल्टीप्लेक्स assays 12,13 के लिए सेंसर की डिजाइन में अतिरिक्त बहुमुखी प्रतिभा की पेशकश. अन्य अनुप्रयोगों प्रतिरक्षा कोशिकाओं 14 के बीच है कि रूपों जंक्शन नकल करने के लिए SLB सरणियों का उपयोग करें. SLB सरणियों के लिए तैयार करने के तरीकों microflu से अलग हैidic आसन्न SLB पैच के बीच शारीरिक बाधाओं को रोजगार है कि उन लोगों के लिए 15 दृष्टिकोण. 16 अन्य समूहों मुद्रण विधियों 17 का इस्तेमाल किया है, प्रकाश रासायनिक patterning 18 और विभिन्न Nanoengineering SLB सरणियों बनाने के लिए 19 दृष्टिकोण.
इस पत्र और साथ वीडियो में हम microwells 20 के आदेश दिए सरणियों में SLB में लिपटे 2 Sio मोती जमा करके SLB सरणियों के गठन के लिए एक विधि का प्रदर्शन. हम गोलाकार समर्थित लिपिड bilayers (SSLBs) के रूप में SLB में लिपटे 2 Sio मोतियों को देखें. इस तकनीक को हम भी उदाहरण परिणाम दिखाने जिसमें से प्राकृतिक स्रोतों 21 से निकाली फॉस्फोलिपिड vesicles और biomembranes की सरणियों बनाया कि पहले काम का एक विस्तार है. Biomembrane कणों या पुटिका arraying के लिए अन्य तरीकों पुटिका सतह पर निहित पूरक ligands के साथ संबद्ध है कि सतहों पर विशिष्ट लक्षित ligands के पैटर्न पर भरोसा किया है. उदाहरण बायोटिन शामिलavidin एसोसिएशन 22,23 और डीएनए संकरण योजनाओं 24. हमारा दृष्टिकोण केवल आवश्यक कोई लक्ष्य या मान्यता moieties साथ एक microwell सरणी की आवश्यकता है. SSLBs का आकार कम पाली dispersity है जो 2 Sio मनका समर्थन करता है, के व्यास से परिभाषित किया गया है. SSLB व्यास की तुलना में सिर्फ बड़ा करने microwell व्यास ट्यूनिंग, केवल एक ही SSLB प्रत्येक microwell में सुलझेगी. एक पाली (dimethylsiloxane) (PDMS) squeegee तो सतह से microwells में स्थिर नहीं कर रहे हैं कि सभी SSLBs हटा. microwells और परिणामी SSLB सरणियों 3 माइक्रोन केंद्र के लिए केंद्र रिक्ति और हेक्सागोनल अवधि के साथ उच्च घनत्व (~ 10 5 SSLBs / 2 मिमी) है. क्रमानुसार अलग लिपिड रचनाओं के साथ SSLBs जमा करके, यह अनियमित तैनात SSLBs साथ multicomponent सरणियों बनाने के लिए संभव है. SSLB सरणियों की संवेदन क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए, हम SSLBs में शामिल एक ganglioside (GM1) के साथ हैजा विष (सीटीएक्स) की बातचीत का इस्तेमाल किया. साथप्राकृतिक झिल्ली कण, हम दो अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं से झिल्ली सामग्री युक्त multicomponent सरणियों में सेल विशिष्ट लिपिड पता लगाने में सक्षम थे.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस काम में हम समर्थित लिपिड bilayers साथ लेपित monodisperse 2 Sio मोती लिपिड bilayers या सब्सट्रेट सतह पर ligands को निशाना बनाने के लिए आवश्यकता के बिना microwell सरणियों में तैनात किया जा सकता है, और सरणियों विष लिपिड बातचीत निस्?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (R01 GM092993) से एसएचओ को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF कैरियर पुरस्कार और DBI 0,964,216), नौसेना अनुसंधान कार्यालय (ONR) युवा अन्वेषक कार्यक्रम और जैव प्रौद्योगिकी के लिए मिनेसोटा भागीदारी पुरस्कार और मेडिकल जीनोमिक्स. उपकरण निर्माण राष्ट्रीय नैनो इंफ्रास्ट्रक्चर नेटवर्क के माध्यम से NSF से समर्थन प्राप्त करता है जो मिनेसोटा विश्वविद्यालय Nanofabrication केंद्र (एनएफसी), में प्रदर्शन किया था. यह काम भी स्वास्थ्य (NS048357, R21 NS073684), राष्ट्रीय मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसायटी (CA1060A11), Applebaum, हिल्टन, पीटरसन और सैनफोर्ड मूलाधार और MCNEILUS परिवार के राष्ट्रीय संस्थानों से एमआर को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. लेखकों स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ सहायता के लिए चित्र और Shailabh कुमार के साथ सहायता के लिए Hyungsoon इम धन्यवाद देता हूँ.
Materials
| 4-inch silicon wafers | University Wafer | 425 | |
| Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist | MicroChem | SPR955-CM | |
| Shipley MICROPOSIT CD-26 developer | MicroChem | CD-26 | |
| i-line stepper | Canon | 2500 i3 stepper | |
| Vision 320 reactive ion etcher | Advanced Vacuum | Vision 320 RIE | |
| Deep trench reactive ion etcher | Plasma Therm | SLR-770 | |
| Atomic layer depostion system | Cambridge NanoTech | Savannah | |
| Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| egg phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt | Avanti Polar Lipids | 810158C | |
| monosialoganglioside GM1 | Avanti Polar Lipids | 860065P | |
| Silica beads | Bangs Laboratories | SS03N/4666 | Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter. |
| Cholera toxin B-subunit, Alexa 488 conjugate | Molecular Probes | C-34775 | |
| Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate | R&D Systems | NL1326R | |
| FM1-43 | Molecular Probes | T-3136 | |
| Eppendorf MiniSpin centrifuge | Fisher Scientific | 05-401-09 |
Referências
- Drews, J. Drug discovery: A Historical Perspective. Science. 287 (5460), 1960-1964 (1126).
- Cooper, M. A. Advances in Membrane Receptor Screening and Analysis. J. Mol. Recognit. 17 (4), 286-315 (2004).
- Voskuhl, J., Ravoo, B. J. Molecular Recognition of Bilayer Besicles. Chem. Soc. Rev. 38 (2), 495-505 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (1002).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid Supported Lipid Bilayers: From Biophysical Studies to Sensor Design. Surf. Sci. Rep. 61 (10), 429-444 (2006).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early Steps of Supported Bilayer Formation Probed by Single Vesicle Fluorescence Assays. Biophys. J. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Krysinski, P., Zebrowska, A., Michota, A., Bukowska, J., Becucci, L., Moncelli, M. R. Tethered Mono- and Bilayer Lipid Membranes on Au and Hg. Langmuir. 17 (13), 3852-3857 (2001).
- Li, L., Wang, H. F., Cheng, J. X. Quantitative Coherent anti-Stokes Raman Scattering Imaging of Lipid Distribution in Coexisting Domains. Biophys. J. 89 (5), 3480-3490 (2005).
- Richter, R. P., Brisson, A. R. Following the Formation of Supported Lipid Bilayers on Mica: A Study Combining AFM, QCM-D, and Ellipsometry. Biophys. J. 88 (5), 3422-3433 (2005).
- Dahlin, A., Zäch, M., Rindzevicius, T., Käll, M., Sutherland, D. S., Höök, F. Localized Surface Plasmon Resonance Sensing of Lipid-Membrane-Mediated Biorecognition Events. J. Am. Chem. Soc. 127 (14), 5043-5048 (2005).
- Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase Separation of Lipid Membranes Analyzed with High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry. Science. 313 (5795), 1948-1951 (2006).
- Groves, J. T., Boxer, S. G. Micropattern Formation in Supported Lipid Membranes. Acc. Chem. Res. 35 (3), 149-157 (2002).
- Bally, M., Bailey, K., Sugihara, K., Grieshaber, D., Vörös, J., Stadler, B. Liposome and Lipid Bilayer Arrays Towards Biosensing Applications. Small. 6 (22), 2481-2497 (2010).
- Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported Planar Bilayers in Studies on Immune Cell Adhesion and Communication. J. Immunol. Methods. 278 (1-2), 19-32 .
- Yang, T. L., Jung, S. Y., Mao, H. B., Cremer, P. S. Fabrication of Phospholipid Bilayer-Coated Microchannels for On-Chip Immunoassays. Anal. Chem. 73 (2), 165-169 (2001).
- Groves, J. T., Ulman, N., Boxer, S. G. Micropatterning Fluid Lipid Bilayers on Solid Supports. Science. 275 (5300), 651-653 (1997).
- Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning and Composition Arrays of Supported Lipid Bilayers by Microcontact Printing. Langmuir. 17 (11), 3400-3405 (2001).
- Yee, C. K., Amweg, M. L., Parikh, A. N. Direct Photochemical Patterning and Refunctionalization of Supported Phospholipid Bilayers. J. Am. Chem. Soc. 126 (43), 13962-13972 (2004).
- Kelly, C. V., Craighead, H. G. Nanofabrication for the Analysis and Manipulation of Membranes. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1356-1366 (2012).
- Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Oh, S. H. High-Density Arrays of Submicron Spherical Supported Lipid Bilayers. Anal. Chem. 84 (19), 8207-8213 (2012).
- Wittenberg, N. J., et al. Facile Assembly of Micro- and Nanoarrays for Sensing with Natural Cell Membranes. ACS Nano. 5 (9), 7555-7564 (2011).
- Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (45), 5580-5583 (2003).
- Kalyankar, N. D., et al. Arraying of Intact Liposomes into Chemically Functionalized Microwells. Langmuir. 22 (12), 5403-5411 (2006).
- Dahlin, A. B., Jonsson, M. P., Höök, F. Specific Self-Assembly of Single Lipid Vesicles in Nanoplasmonic Apertures in Gold. Adv. Mater. 20 (8), 1436-1442 (2008).
- Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using Patterned Supported Lipid Membranes to Investigate the Role of Receptor Organization in Intercellular Signaling. Nat. Protoc. 6 (4), 523-539 (2011).
- Kuziemko, G. M., Stroh, M., Stevens, R. C. Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Gangliosides Determined by Surface Plasmon Resonance. Bioquímica. 35 (20), 6375-6384 (1996).
- Moran-Mirabal, J. M., Edel, J. B., Meyer, G. D., Throckmorton, D., Singh, A. K., Craighead, H. G. Micrometer-Sized Supported Lipid Bilayer Arrays for Bacterial Toxin Binding Studies Through Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Biophys. J. 89 (1), 296-305 (2005).
- Shi, J. J., Yang, T. L., Kataoka, S., Zhang, Y. J., Diaz, A. J., Cremer, P. S. GM1 Clustering Inhibits Cholera Toxin Binding in Supported Phospholipid Membranes. J. Am. Chem. Soc. 129 (18), 5954-5961 (2007).
- Gill, D. M. The Arrangement of Subunits in Cholera Toxin. Bioquímica. 15 (6), 1242-1248 (1021).
- Weng, K. C., Kanter, J. L., Robinson, W. H., Frank, C. W. Fluid Supported Lipid Bilayers Containing Monosialoganglioside GM1: A QCM-D and FRAP study. Colloid Surface B. 50 (1), 76-84 (1016).
- Walt, D. R. Fibre Optic Microarrays. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 38-50 (2010).
- Bake, K. D., Walt, D. R. Multiplexed Spectroscopic Detections. Annu. Rev. Anal. Chem. 1 (1), 515-547 (2008).
- Kundu, J., Levin, C. S., Halas, N. J. Real-Time Monitoring of Lipid Transfer Between Vesicles and Hybrid Bilayers on Au Nanoshells Using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS). Nanoscale. 1 (1), 114-117 (2009).
- Junesch, J., Sannomiya, T., Dahlin, A. B. Optical Properties of Nanohole Arrays in Metal-Dielectric Double Films Prepared by Mask-on-Metal Colloidal Lithography. ACS Nano. 6 (11), 10405-10415 (2012).
- Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).
- Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).
- Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads. J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).
