הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית
Summary
כאן, אנו מתארים מתודולוגיה לבצע siRNA ממוקד מסך "ubiquitome" לזהות היוביקוויטין רומן ורגולטורים כמו היוביקוויטין של התגובה התאית בתיווך HIF1A להיפוקסיה. זה יכול להיות מותאם לכל מסלול ביולוגי שבו חזקה לקריאה מהפעילות העיתונאית היא זמינה.
Abstract
שינוי שלאחר translational של חלבונים עם מולקולות יוביקוויטין וכמו היוביקוויטין (UBLs) מתגלה כרשת איתות תאית דינמית המווסתת את המסלולים ביולוגיים מגוונים כולל תגובת היפוקסיה, proteostasis, תגובת הנזק לדנ"א ושעתוק. כדי להבין טוב יותר כיצד UBLs להסדיר מסלולים רלוונטיים למחלות בבני אדם, יש לנו מלוקט siRNA אנושי "ubiquitome" ספרייה בהיקף של 1,186 בריכות דופלקס siRNA מיקוד כל ידוע וחזויי רכיבים של מסלולי מערכת UBL. ספרייה זו יכולה להיות מוקרנת נגד מגוון רחב של שורות תאים להביע כתבים של מסלולים ביולוגיים מגוונים כדי לקבוע אילו רכיבי UBL לפעול כרגולטורים חיוביים או שליליים של המסלול בשאלה. כאן אנו מתארים פרוטוקול ניצול בספרייה זו כדי לזהות ubiquitome-רגולטורים של התגובה התאית בתיווך HIF1A היפוקסיה באמצעות כתב בלוציפראז מבוסס שעתוק. שלב פיתוח assay ראשונימבוצע כדי לקבוע פרמטרים הקרנה מתאימים של הקו הסלולרי לפני ביצוע המסך בשלושה שלבים: הקרנה / deconvolution ראשונית, שניונית ושלישוניים. השימוש ממוקד על ספריות siRNA הגנום כולו הופך לפופולרי יותר ויותר כפי שהוא מציע את היתרון של דיווח רק על חברים של המסלול שבו החוקרים מעוניינים ביותר. למרות מגבלות מובנות של הקרנת siRNA, בפרט שווא חיובי שנגרם על ידי siRNA השפעות מחוץ היעד, זיהוי של רגולטורים רומן אמיתיים של המסלולים בשאלה עולה ליקויים אלה, אשר ניתן להתגבר על ידי ביצוע סדרה של ניסויי שליטה התחייבו בזהירות.
Introduction
שינוי של חלבונים עם מולקולות יוביקוויטין וכמו היוביקוויטין (UBLs) מייצג מערכת ביוכימית רחבת ידיים המווסתת את המסלולים ביולוגיים מגוונים ותגובות לחץ. הקובץ המצורף קוולנטיים של UBLs לחלבוני היעד שלהם יכול להיות תוצאות שונות המסדירות את היציבות, לוקליזציה, פונקציה או interactome של המצע 1. הצעדים האנזימטית שבבסיס שינוי UBL הוקמו ראשון ליוביקוויטין, וכעת משמשים כמופת לשינוי עם רוב UBLs, כולל SUMO, NEDD8, ISG15 וFAT10. ללהתרחש שינוי, קבוצת carboxylate של מוטיב diglycine UBL מופעלת לראשונה על ידי אנזים הפעלת E1 כדי ליצור תיאול עתירה אנרגיה שמועברת לציסטאין הפעיל באתר של אנזים conjugating E2. E2 אז אינטראקציה עם האנזים E3 בכריכת מצע לתווך העברת UBL על (בדרך כלל) שאריות ליזין יעד יצירת מסועפת שרשרת (isopeptide) הצמדה 2. סיבובים רצופים של שינוי יכולים להתרחש לבנות רשתות isopeptide על גבי המצע, אשר להיוביקוויטין יכול להתרחש דרך כל השבעה lysines, או באמצעות מתיונין N-המסוף שלה כדי ליצור שרשרות יוביקוויטין ליניארי. שינויים אלה יוצרים טופולוגיות דיסקרטיות עם מטרות מגוונות כגון יצירת מוטיבים אינטראקציה חדשות ומיקוד חלבונים להשפלה לפני הסרת UBL ידי פרוטאזות מומחה. במקרה של היוביקוויטין יש שני E1 אנזימים, 30-40 אנזימי conjugating E2, לפחות 600 E3 ligases וכ 100 אנזימים deubiquitylating (ממכנים). בעוד שהמסלולים הם פחות מרחיב לאחר 10 או כך UBLs, מורכבות ubiquitome הכוללות מאפשרת גיוון עצום בתוצאה הביולוגית של שינוי UBL מסוים. עם זאת, בעוד התקדמות גדולה בביולוגיה UBL נעשה, התפקידים הסלולריים המדויקים של רוב רכיבי ubiquitome אלה אינם ידועים.
השימוש בint הקצרחומצת erfering ריבונוקלאית (siRNAs) התפתחה ככלי רב עוצמה בגנטיקה הפוכה בשל היכולת של siRNAs למקד במיוחד mRNAs הסלולרי להשמדה, מה שמאפשר את תפקידם של גנים בודדים כדי להיבחן בהקשרים ביולוגיים שונים 3. מסכי הגנום כולו נעשו שימוש כדי לזהות ולאמת רגולטורים חדשים של תהליכים תאיים רבים, ויצרו שפע של מידע שימושי לנגיש לקהילה המדעית הרחבה יותר. עם זאת, בעוד מסכי הגנום כולו הוכיחו מאוד שימושיים, מסכי ממוקדים הופכים פופולריים יותר ויותר כמו שהם זולים יותר, מהירים יותר, כרוכים בפחות ניהול נתונים ודיווח רק על חברים של הגנום שבו החוקר הוא מעוניין ביותר. לכן, כדי להבין טוב יותר אילו רכיבי משפחת התהליכים תאיים UBL מעורבים, יש לנו מלוקט ספרייה אנושית siRNA מיקוד כל ידוע וחזויי מרכיבי ubiquitome. זה כולל את UBLs, אנזימי הפעלת E1, E2 conjugatingאנזימים, ligases E3, מחייב רישום היוביקוויטין (UBD) המכיל חלבונים וממכנים. ספרייה זו יכולה לשמש למסך נגד מגוון רחב של שורות תאי כתב של בעיות ביולוגיות שונות, ובכך מאפשרת זיהוי משוחד של רכיבי UBL רומן המסדירים מסלולים אלה.
הפרוטוקול הבא מתאר כיצד לבצע siRNA ממוקד קפדני ubiquitome מסך לזהות רגולטורים רומן של תגובת HIF1A תלויה להיפוקסיה. תחת מתח חמצן רגיל, HIF1A כפוף להידרוקסילציה prolyl שגורם לו להיות מוכרים וממוקדות לשפלה על ידי פון היפל לינדאו (VHL) מורכב האנזים E3 4. היפוקסיה מעכבת הידרוקסילציה prolyl המובילה להתייצבות HIF1A ובה לאחר מכן מחייב אלמנטי תגובת היפוקסיה (HREs) לנהוג ביטוי גנים. כאן, אנו מתארים מסך באמצעות תאי אוסטאוסרקומה U20S יציבות להביע גחלילית בלוציפראז תחת שליטתו של שלושה עותקי טנדם של Hypoxia תגובת אלמנט (תאי U20S-HRE) 5. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לכל מסלול ביולוגי אם קריאה מתוך חזק של פעילות העיתונאית הוא בר השגה והוא יכול להיות בשילוב עם בקרות חיוביות ושליליות מתאימות.
Protocol
Representative Results
Discussion
השימוש במסכי siRNA הגנום בתאי יונקים הוכיחו להיות יקר מאוד בזיהוי רגולטורים רומן של מסלולים ביולוגיים מובהקים. הנה, יש לנו תיארתי את השימוש במסך siRNA ubiquitome ממוקד לזהות רגולטורים של התגובה התאית בתיווך HIF1A להיפוקסיה. מסכי ממוקדים הופכים אטרקטיביים יותר ויותר כמו שהם בדרך…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן Wellcome, GlaxoSmithKline (GSK) ואת המכון הסקוטי לאיתות סלולרי (כיום חלק של זירחון חלבון MRC ויחידת Ubiquitylation).
Materials
| Automated Liquid Dispenser | Fluid-X | XPP-721 | http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html |
| Automated cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | http://www.nexcelom.com/Cellometer-Auto-T4/index.html |
| Hypoxia Workstation | Ruskin | In vivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 |
| Automated Cell Dispenser | Thermo Scientific | Matrix Wellmate | http://www.matrixtechcorp.com/automated/pipetting.aspx?id=11 |
| Plate Shaker | Heidolph | Titramax 1000 | http://www.heidolph-instruments.co.uk/products/shakers-mixers/platform-shakers/vibrating/titramax/titramax-1000/ |
| Luminometer | Perkin Elmer | Envision 2104 Multilabel Reader | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Family/ID/EnVision%20Multilabel%20Plate%20Readers |
| White Walled Assay Plate | Greiner Bio One | 655083 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/ |
| Clear Plate Film | Perkin Elmer | 1450-461 | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461 |
| Name of the Reagent | |||
| siRNA library | Thermo Scientific | On-Target Plus | http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/ |
| Transfection reagent | Invitrogen | Lipofectamine RNAimax | http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html |
| Reduced Serum Medium | Invitrogen | Optimem | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039# |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product# |
| Tryspin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product# |
Referências
- Hochstrasser, M. Origin and function of ubiquitin-like proteins. Nature. 458, 422-429 (2009).
- Schulman, B. A., Harper, J. W. Ubiquitin-like protein activation by E1 enzymes: the apex for downstream signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 319-331 (2009).
- Siomi, H., Siomi, M. C. On the road to reading the RNA-interference code. Nature. 457, 396-404 (2009).
- Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway. Mol Cell. 30, 393-402 (2008).
- Melvin, A., Mudie, S., Rocha, S. The chromatin remodeler ISWI regulates the cellular response to hypoxia: role of FIH. Mol Biol Cell. 22, 4171-4181 (2011).
- Bhinder, B., Djaballah, H. A simple method for analyzing actives in random RNAi screens: introducing the "H Score" for hit nomination & gene prioritization. Comb Chem High Throughput Screen. 15, 686-704 (2012).
- Bett, J. S., et al. The P-body component USP52/PAN2 is a novel regulator of HIF1A mRNA stability. Biochem J. 451, 185-194 (2013).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat Methods. 6, 569-575 (2009).
- Stagg, H. R., et al. The TRC8 E3 ligase ubiquitinates MHC class I molecules before dislocation from the ER. J Cell Biol. 186, 685-692 (2009).
- Zhang, Y., et al. RNF146 is a poly(ADP-ribose)-directed E3 ligase that regulates axin degradation and Wnt signalling. Nat Cell Biol. 13, 623-629 (2011).
- Jackson, A. L., et al. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Birmingham, A., et al. 3′ UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets. Nat Methods. 3, 199-204 (2006).
- . Whither RNAi. Nat Cell Biol. 5, 489-490 (2003).
