миРНК Скрининг для идентификации Убиквитин и Убиквитин-подобной системе регуляторов биологических путей в культивируемых клетках млекопитающих
Summary
Здесь мы описываем методологию для выполнения целевой миРНК экрана "ubiquitome" для идентификации новых убиквитин и убиквитин-как регуляторов HIF1A опосредованного клеточного ответа на гипоксию. Это может быть адаптирована к любой биологической реакции, где надежной чтения из репортерной активности доступен.
Abstract
Пост-трансляционной модификации белков с убиквитиновых и убиквитиновых-подобных молекул (UBLs) становится динамичной сети сотовой сигнализации, которая регулирует разнообразные биологические пути в том числе реагирования гипоксия, proteostasis, в ответ на повреждения ДНК и транскрипции. Чтобы лучше понять, как UBLs регулировать пути, имеющие отношение к человеческой болезни, мы составили человека миРНК "ubiquitome" библиотека, состоящая из 1186 миРНК дуплексных бассейнов, ориентированных на все известные и предсказал компоненты системы путей UBL. Эта библиотека может быть экранированы против ряда клеточных линий, выражающих журналистам разнообразных биологических путей, чтобы определить, какие компоненты УБЛ действуют как положительные или отрицательные регуляторов пути в вопросе. Здесь мы опишем протокол, использующий эту библиотеку, чтобы определить ubiquitome-регуляторы на HIF1A опосредованного клеточного ответа на гипоксию, используя транскрипции на основе люциферазы репортера. Начальная стадия развития анализавыполняется установить подходящие параметры отбора в клеточной линии, прежде чем выполнять экран в три этапа: первичная, вторичная и третичная скрининга / деконволюция. Использование целевых над целые библиотеки генома миРНК становится все более популярным, поскольку это дает преимущество отчетности только на членов пути, с которой следователи наиболее заинтересованы. Несмотря ограничений, присущих миРНК скрининга, в частности ложных срабатываний вызвано миРНК мимо ворот эффектов, выявление подлинных новых регуляторов путей в вопросе перевешивают эти недостатки, которые могут быть преодолены путем выполнения серию тщательно предпринятых контрольных опытов.
Introduction
Модификация белков с убиквитиновых и убиквитиновых-подобных молекул (UBLs) представляет обширный биохимической системы, которая регулирует разнообразные биологические пути и ответные реакции на стресс. Ковалентное присоединение UBLs их белков-мишеней может иметь различные результаты, регулирующие стабильность, локализацию, функцию или интерактома подложки 1. Ферментативные шаги, лежащие в основе модификации UBL впервые были созданы для убиквитином, и в настоящее время служат в качестве парадигмы для модификации с большинством UBLs, в том числе сумо, NEDD8, ISG15 и FAT10. Для изменения происходят, карбоксилат группа diglycine мотив UBL сначала активируется активирующего фермента E1 для формирования высокой энергии тиол, что передается на активно-сайте цистеина в сопрягающего фермента Е2. Е2 затем взаимодействует с подложки с привязкой E3 лигазы посредничать передачу УБЛ на (обычно) целевой остаток лизина создания разветвленной цепью (изопептида) связи 2. Последовательных циклов модификации могут иметь место, чтобы построить изопептида цепи на подложку, которая для убиквитина может происходить через любой из семи лизина, или через его N-концевого метионина, чтобы создать линейные цепочки убиквитин. Эти изменения формируют дискретные топологии с различных целей, таких как создание новых мотивов взаимодействия и ориентации белки для деградации до удаления UBL специалистом протеаз. В случае убиквитина есть два E1 ферменты, 30-40 E2 сопрягающие ферменты, по крайней мере, 600 E3 лигазы и примерно 100 deubiquitylating ферменты (дублирует). В то время как пути менее экспансивным для других 10 или около того UBLs, общая сложность ubiquitome дает огромное разнообразие в биологической исход конкретного модификации UBL. Тем не менее, в то время как крупные успехи в UBL биологии были сделаны, точные сотовые роли большинства этих компонентов ubiquitome остаются неизвестными.
Использование короткого междунарerfering рибонуклеиновая кислота (миРНК) стала мощным инструментом в обратной генетики из-за способности миРНК непосредственно для клеточных мРНК для уничтожения, позволяя роль отдельных генов, которые будут рассмотрены в различных биологических контекстах 3. Целые экраны генома были использованы для идентификации и проверки новых регуляторов многих клеточных процессах, и создали множество полезных данных, доступную для широкой научной общественности. Тем не менее, в то время как целые экраны генома оказались крайне полезными, целевые экраны становятся все более популярными, поскольку они дешевле, быстрее, привлечь меньше по управлению данными и отчет только на членов генома, в котором следователь является наиболее заинтересованы. Поэтому, чтобы лучше понять, какие компоненты семейства клеточные процессы УБЛ участвуют в, мы составили человеческого библиотеку миРНК ориентации все известные и предсказал компоненты ubiquitome. Это включает в себя UBLs, E1 активирующие ферменты, E2 сопрягающихферменты, E3 лигазы, убиквитин-связывающий домен (UBD), содержащих белки и называет. Эта библиотека может быть использована для экрана против широкого спектра линий репортер клеток различных биологических проблем, что позволяет объективную идентификацию новых компонентов UBL, регулирующих эти пути.
Следующий протокол описывает, как выполнить строгий целевых миРНК ubiquitome экран для определения новых регуляторов в HIF1A-зависимых ответ на гипоксию. При нормальном давлении кислорода, HIF1A подлежит пролил гидроксилирования, что приводит к его признать и направлены на деградацию по Гиппеля Линдау (ВХЛ) E3 лигазы комплекса 4. Гипоксия ингибирует пролил гидроксилирование, ведущие к стабилизации HIF1A и его последующего связывания с чувствительными элементами гипоксии (HRES) для управления экспрессией генов. Здесь мы описываем экран использованием клеток остеосаркомы U20S, стабильно экспрессирующих светлячка люциферазы под контролем трех тандемных копий Hypoxia элемент, отвечающий (U20S-HRE клетки) 5. Этот протокол может быть адаптирован для любой биологической реакции, если надежным для чтения из репортерной активности достижимо и может быть соединен с соответствующими положительным и отрицательным контролем.
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование генома экранов миРНК в клетки млекопитающих оказалась чрезвычайно ценным в определении новых регуляторов различных биологических путей. Здесь мы описали использование целевой экране ubiquitome миРНК для выявления регуляторов HIF1A опосредованного клеточного ответа на гипок…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Wellcome Trust, GlaxoSmithKline (GSK) и шотландского Института клеточной сигнализации (теперь часть из фосфорилирования белков MRC и Ubiquitylation блока).
Materials
| Automated Liquid Dispenser | Fluid-X | XPP-721 | http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html |
| Automated cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | http://www.nexcelom.com/Cellometer-Auto-T4/index.html |
| Hypoxia Workstation | Ruskin | In vivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 |
| Automated Cell Dispenser | Thermo Scientific | Matrix Wellmate | http://www.matrixtechcorp.com/automated/pipetting.aspx?id=11 |
| Plate Shaker | Heidolph | Titramax 1000 | http://www.heidolph-instruments.co.uk/products/shakers-mixers/platform-shakers/vibrating/titramax/titramax-1000/ |
| Luminometer | Perkin Elmer | Envision 2104 Multilabel Reader | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Family/ID/EnVision%20Multilabel%20Plate%20Readers |
| White Walled Assay Plate | Greiner Bio One | 655083 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/ |
| Clear Plate Film | Perkin Elmer | 1450-461 | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461 |
| Name of the Reagent | |||
| siRNA library | Thermo Scientific | On-Target Plus | http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/ |
| Transfection reagent | Invitrogen | Lipofectamine RNAimax | http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html |
| Reduced Serum Medium | Invitrogen | Optimem | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039# |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product# |
| Tryspin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product# |
Referências
- Hochstrasser, M. Origin and function of ubiquitin-like proteins. Nature. 458, 422-429 (2009).
- Schulman, B. A., Harper, J. W. Ubiquitin-like protein activation by E1 enzymes: the apex for downstream signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 319-331 (2009).
- Siomi, H., Siomi, M. C. On the road to reading the RNA-interference code. Nature. 457, 396-404 (2009).
- Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway. Mol Cell. 30, 393-402 (2008).
- Melvin, A., Mudie, S., Rocha, S. The chromatin remodeler ISWI regulates the cellular response to hypoxia: role of FIH. Mol Biol Cell. 22, 4171-4181 (2011).
- Bhinder, B., Djaballah, H. A simple method for analyzing actives in random RNAi screens: introducing the "H Score" for hit nomination & gene prioritization. Comb Chem High Throughput Screen. 15, 686-704 (2012).
- Bett, J. S., et al. The P-body component USP52/PAN2 is a novel regulator of HIF1A mRNA stability. Biochem J. 451, 185-194 (2013).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat Methods. 6, 569-575 (2009).
- Stagg, H. R., et al. The TRC8 E3 ligase ubiquitinates MHC class I molecules before dislocation from the ER. J Cell Biol. 186, 685-692 (2009).
- Zhang, Y., et al. RNF146 is a poly(ADP-ribose)-directed E3 ligase that regulates axin degradation and Wnt signalling. Nat Cell Biol. 13, 623-629 (2011).
- Jackson, A. L., et al. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Birmingham, A., et al. 3′ UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets. Nat Methods. 3, 199-204 (2006).
- . Whither RNAi. Nat Cell Biol. 5, 489-490 (2003).
