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Immunology and Infection

टी सेल प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के लिए फ्लोरोसेंट लक्ष्य सारणियों का प्रयोग करें Published: June 19, 2014 doi: 10.3791/51627
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Immunology, John Curtin School of Medical Research, Australian National University

Summary

विवो में विस्तार से टी सेल प्रतिक्रिया की निगरानी करने की क्षमता के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के बारे में हमारी समझ के विकास के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ हम फ्लो द्वारा एक साथ> 250 मापदंडों का आकलन है कि एक Vivo में टी सेल परख में फ्लोरोसेंट लक्ष्य सरणियों (एफटीए) के उपयोग का वर्णन.

Abstract

विवो में टी सेल प्रतिक्रिया की निगरानी करने की क्षमता के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के बारे में हमारी समझ के विकास और immunotherapies के डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण है. और लाल लेजर उत्तेजनीय रंजक (सेल प्रसार डाई eFluor 670: यहाँ हम ऐसे carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE), बैंगनी लेजर उत्तेजनीय रंजक (केबल टीवी CellTrace वायलेट): के रूप में महत्वपूर्ण रंगों का इस्तेमाल करता है जो फ्लोरोसेंट लक्ष्य सरणी (एफटीए) तकनीक के उपयोग का वर्णन सीपीडी )> 250 discernable फ्लोरोसेंट सेल समूहों में लेबल माउस लिम्फोसाइटों combinatorially लिए. इन एफटीए के भीतर सेल समूहों प्रमुख उतक अनुरूपता (MHC) वर्ग मैं और MHC वर्ग द्वितीय बाध्यकारी पेप्टाइड्स के साथ स्पंदित और इस तरह क्रमश: सीडी 8 + और ​​सीडी 4 + टी कोशिकाओं, के लिए लक्ष्य कोशिकाओं के रूप में कार्य किया जा सकता है. ये एफटीए कोशिकाओं व्यवहार्य और पूरी तरह कार्यात्मक रहते हैं, और इसलिए एफटीए लक्ष्य कोशिकाओं और सीडी 4 + टी सेल तप हेल की सीडी 8 + टी सेल की मध्यस्थता हत्या के आकलन की अनुमति के लिए चूहों में प्रशासित किया जा सकता हैफ्लो द्वारा vivo में वास्तविक समय में मुक्त व्यापार समझौते बी सेल लक्ष्य कोशिकाओं के पी. > 250 लक्ष्य कोशिकाओं को एक बार में मूल्यांकन किया जा सकता है, तकनीक कई सांद्रता में और कई replicates में कई प्रतिजन epitopes के खिलाफ टी सेल प्रतिक्रिया की निगरानी की अनुमति देता है. जैसे, तकनीक एक मात्रात्मक (प्रतिक्रिया की जैसे संचयी परिमाण) और एक गुणात्मक (जैसे. कार्यात्मक उत्सुकता और प्रतिक्रिया का मिलान पार जेट) दोनों स्तर पर टी सेल प्रतिक्रिया उपाय कर सकते हैं. इस के साथ साथ, हम इन एफटीए का निर्माण किया है और वे एक पुनः संयोजक चेचक वायरस वैक्सीन से प्रेरित टी सेल प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है की एक उदाहरण दे रहे हैं क्या करते हैं.

Introduction

टी कोशिकाओं अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं और अक्सर immunotherapy में हेरफेर के लिए लक्षित कर रहे हैं. सीडी 4 + effector टी कोशिकाओं प्रतिरक्षा के कई पहलुओं को विनियमित और भी सीधे एंटीबॉडी का निर्माण करने के लिए बी कोशिकाओं की मदद कर सकते हैं कि साइटोकिन्स स्रावित द्वारा विदेशी प्रतिजन का जवाब. सीडी 8 + साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं (CTLs) भी साइटोकिन्स स्रावित करने के साथ ही सीधे एक विदेशी प्रतिजन व्यक्त कोशिकाओं को मारने में एक केंद्रीय भूमिका निभाने से विदेशी प्रतिजन का जवाब कर सकते हैं. इन टी सेल प्रेरक कार्यों को शुरू करता है मौलिक बातचीत कोशिकाओं की सतह पर MHC अणुओं पर प्रदर्शित विदेशी पेप्टाइड्स के साथ टी सेल रिसेप्टर (TCR) की बातचीत शामिल है. सीडी 4 + टी कोशिकाओं आम तौर पर सूक्ष्म जीव संक्रमित कोशिकाओं पर प्रदर्शित कर रहे हैं कि MHC वर्ग मैं अणुओं पर प्रदर्शित पेप्टाइड्स पहचान प्रतिजन कोशिकाओं और सीडी 8 + टी कोशिकाओं पर MHC वर्ग द्वितीय अणुओं पर प्रदर्शित पेप्टाइड्स पहचान.

आदेश मेंटी कोशिकाओं एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में खेलने की भूमिका का आकलन करने के लिए, यह उनके प्रेरक कार्यों विश्वसनीय और संवेदनशील तकनीक से मापा जाता है कि आवश्यक है. टी सेल प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के लिए आम तरीकों में शामिल हैं; MHC class-I/II/peptide टेट्रामर जेट; ELISPOT और intracellular साइटोकाइन धुंधला द्वारा cytokine उत्पादन; और 51 करोड़ रिलीज assays के द्वारा क्षमता मौत हो गई. ये assays, हालांकि, आम तौर पर इन विट्रो उत्तेजना के साथ पूर्व vivo प्रदर्शन किया, या टी सेल समारोह में सीमित अंतर्दृष्टि प्रदान कर रहे हैं. टी सेल प्रतिक्रिया को मापने जब ​​इन विट्रो उत्तेजना के माध्यम से हो सकता है कि कार्यात्मक मापदंडों में परिवर्तन से बचने के लिए वे टी कोशिकाओं की कोई हेरफेर के साथ होते हैं, के रूप में आदर्श रूप में, यह vivo में, बगल में उन्हें मूल्यांकन करने के लिए लाभप्रद होगा. सबसे अधिक विवो टी सेल कार्यात्मक assays में इस्तेमाल के कुछ विवो में enumerated हैं कि MHC वर्ग मैं बाध्यकारी पेप्टाइड्स के साथ स्पंदित लक्ष्य कोशिकाओं की सीटीएल मध्यस्थता हत्या, मापने पर आधारित हैंऐसे CFSE के रूप में महत्वपूर्ण रंगों के साथ फ्लोरोसेंट लेबलिंग के माध्यम से उनकी पहचान के माध्यम से. वे विवो में हुआ जब assays के इन प्रकार के लक्ष्य का सीटीएल मध्यस्थता हत्या की निगरानी कर सकते हैं, वे पहले से गुणात्मक पैरामीटर ऐसी अनुमति देने के लिए आवश्यक है जो अलग सांद्रता और पेप्टाइड epitopes के विभिन्न प्रकार, पेश कई लक्ष्यों की हत्या का आकलन करने के लिए एक अपेक्षाकृत सीमित क्षमता पड़ा है के रूप में कार्य उत्सुकता और मिलान संस्करण पार जेट मूल्यांकन किया जाना है. ये assays भी सीडी 4 + टी सेल की मध्यस्थता प्रतिक्रियाओं पर कोई जानकारी उपलब्ध नहीं है.

हमने हाल ही में से एक जानवर में एक साथ> 250 लक्ष्य कोशिकाओं के खिलाफ टी सेल प्रतिक्रिया की निगरानी की अनुमति देता है जो फ्लोरोसेंट लक्ष्य सरणियों (एफटीए) पर आधारित एक मल्टीप्लेक्स परख विकसित किया है, टी सेल प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए इस्तेमाल मौजूदा तरीकों के साथ सीमाओं के कई दूर करने के लिए 1, 2 प्रवाह cytometry. एफटीए सेव साथ लेबल लिम्फोसाइटों के शामिल हैंअद्वितीय प्रतिदीप्ति की> 250 सेल समूहों उत्पन्न करने की अनुमति CFSE, रंगीन टीवी और सीपीडी जैसे महत्वपूर्ण रंगों के आम सांद्रता और संयोजन. इन कोशिकाओं व्यवहार्य और पूरी तरह कार्यात्मक रहते हैं, वे इन विवो 3 में effector टी कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत की निगरानी की अनुमति के लिए पशुओं में इंजेक्ट किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, मुक्त व्यापार समझौते सेल समूहों लक्ष्य कोशिकाओं 1 के प्रतिजन विशेष सीटीएल मध्यस्थता हत्या के आकलन की अनुमति के लिए MHC वर्ग मैं बाध्यकारी पेप्टाइड्स के साथ स्पंदित किया जा सकता है. इसके अलावा, मुक्त व्यापार समझौते सेल समूहों को भी अनुमति देता है, MHC वर्ग द्वितीय बाध्यकारी पेप्टाइड्स के साथ स्पंदित किया जा सकता है प्रतिजन विशेष टी सहायक सेल ऐसे CD69, CD44 और / या के रूप में सक्रियण मार्कर के आकलन से (सक्रियण का आकलन करने से (टी एच) गतिविधि का आकलन आत्मीय पेप्टाइड 2 असर एफटीए के भीतर बी कोशिकाओं की CD62L). 250 से अधिक लक्ष्यों को एक साथ पता लगाया जा सकता है, यह एन के साथ स्पंदित कई लक्ष्य सेल समूहों के खिलाफ सीटीएल और टी एच प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए संभव हैअलग सांद्रता और कई replicates के शामिल किए जाने पर umerous पेप्टाइड्स. एफटीए परख इसलिए vivo में टी सेल प्रेरक प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के लिए एक अभूतपूर्व स्तर प्रदान करता है.

यहाँ हम विस्तार में एक मुक्त व्यापार समझौते के निर्माण का वर्णन है और वे इन विवो में टी सेल प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है कि कैसे दिखा. प्रक्रिया MHC वर्ग मैं और द्वितीय बाध्यकारी पेप्टाइड्स के साथ स्पंदित 42 सेल समूहों के 6 दोहराता के शामिल तीन महत्वपूर्ण रंगों के उपयोग के माध्यम से 252 से discernable सेल समूहों के शामिल एक मुक्त व्यापार समझौते के निर्माण का वर्णन करता है. लेबलिंग की राशि को कम करने के लिए आवश्यक के रूप में 42 सेल समूहों की लेबलिंग ट्यूब तली 10 मिलीलीटर शंक्वाकार में होता है और यह 1 टेबल में दर्शाया के रूप में एक ट्यूब रैक में इन बाहर रखना करने के लिए सहायक है. इस विधि से discernable समूहों की छोटी संख्या के लिए समायोजित किया जा सकता है का हर रंग 1 का प्रदर्शन किया.

हम यह respons उपाय कर सकते हैं कि कैसे दिखाकर परख की उपयोगिता पर प्रकाश डालाचूहों के एक छोटे पलटन में कई epitopes के खिलाफ पुनः संयोजक चेचक वायरस टीकाकरण द्वारा उत्पन्न तों. यह मुक्त व्यापार समझौते परख, क्रमशः, के माध्यम से वक्र (नीलामी) के मूल्यांकन और आधा अधिक से अधिक प्रतिक्रियाओं (ईसी 50) उत्पन्न करने के लिए आवश्यक प्रभावी पेप्टाइड एकाग्रता की माप के तहत क्षेत्र के उपयोग संचयी प्रतिक्रियाओं और कार्यात्मक उत्सुकता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे पता चलता है.

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल के तहत इस्तेमाल चूहों आस्ट्रेलियन नेशनल यूनिवर्सिटी पशु प्रयोग आचार समिति के दिशा निर्देशों और चूहों के अनुसार संभाल रहे थे ग्रीवा अव्यवस्था से euthanized किया गया.

1. डाई और पेप्टाइड तैयारी

  1. डाई तैयारी
    नोट: रंगों असतत प्रतिदीप्ति तीव्रता में कोशिकाओं की लेबलिंग की अनुमति के लिए विभिन्न सांद्रता में prediluted रहे हैं. CFSE 3.5 गुना धारावाहिक dilutions के माध्यम से किए गए सात मात्रा में प्रयोग किया जाता है, और केबल टीवी और सीपीडी (2-4 टेबल्स देखें) 3.7 गुना धारावाहिक dilutions के माध्यम से किए गए छह अलग सांद्रता में उपयोग किया जाता है. टेबल्स 2-4 में सूचीबद्ध रंगों का जायजा सांद्रता टेबल्स 2-4 में सूचीबद्ध अंतिम डाई सांद्रता में लक्ष्य कोशिकाओं लेबल का उपयोग किया जाएगा. रंगों जलीय समाधान के लिए जोखिम पर प्रतिक्रिया. यह शीशियों पूर्व संक्षेपण को रंगों के जोखिम को कम करने के लिए खोलने के लिए आर टी के लिए equilibrated किया कि इसलिए यह महत्वपूर्ण है.
    1. CFSE
      नोट: CFSE carboxyfluorescein Diacetate succinimidyl एस्टर (CFDA, एसई, मेगावाट 557.47) के रूप में खरीदा जाता है, आम तौर पर 25 मिलीग्राम / शीशी में,.
      1. एक 10 मिमी शेयर समाधान प्राप्त करने के लिए 4.48 मिलीलीटर DMSO में CFSE की 25 मिलीग्राम Resuspend.
      2. क्रमानुसार CFSE पतला: DMSO के 87.5 μl में 10 मिमी CFSE स्टॉक के 35 μl जोड़ें और 3 तालिका में प्रत्येक डाई एकाग्रता देने के लिए पतला शेयर समाधान के साथ इस दोहराएँ.
    2. केबल टीवी
      नोट: केबल टीवी आमतौर पर रंग की एक 10 मिमी समाधान उत्पन्न करने के लिए DMSO के 10 μl के साथ पुनर्गठन किया जा सकता है, जिनमें से प्रत्येक 9 शीशियों, के पैक में खरीदा जाता है.
      1. Reconstitute और एक 10 मिमी समाधान देने के लिए DMSO के 90 μl के साथ केबल टीवी के सभी 9 शीशियों पूल.
      2. क्रमानुसार रंगीन टीवी पतला: DMSO के 29.7 μl में 10 मिमी रंगीन टीवी स्टॉक के 11 μl जोड़ें और 2 तालिका में प्रत्येक डाई एकाग्रता देने के लिए पतला शेयर समाधान के साथ इस दोहराएँ.
    3. सीपीडी
      नोट: सीपीडी (मेगावाट 792.6) ठेठ हैly 0.5 मिलीग्राम / शीशी के रूप में खरीदा.
      1. एक 10 मिमी समाधान पाने के लिए DMSO के 63 मिलीलीटर में सीपीडी की Resuspend 0.5 मिग्रा.
      2. क्रमानुसार सीपीडी पतला: DMSO के 29.7 μl में 10 मिमी सीपीडी स्टॉक के 11 μl जोड़ें और 4 तालिका में प्रत्येक डाई एकाग्रता देने के लिए पतला शेयर समाधान के साथ इस दोहराएँ.
        नोट: डाई शेयरों कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और समारोह में उल्लेखनीय कमी के बिना कई बार thawed और refrozen किया जा सकता है.
  2. पेप्टाइड तैयारी
    नोट: 1 माइक्रोन (5 तालिका) की एक प्रारंभिक एकाग्रता से 10 गुना dilutions का उपयोग किया MHC वर्ग मैं बाध्यकारी पेप्टाइड्स आम तौर पर 6 अलग सांद्रता में लक्ष्य कोशिकाओं नाड़ी के लिए उपयोग किया जाता है. 400 माइक्रोन (5 तालिका) की एक प्रारंभिक एकाग्रता से 3 गुना dilutions का उपयोग किया MHC वर्ग द्वितीय बाध्यकारी पेप्टाइड्स आम तौर पर 6 अलग सांद्रता में लक्ष्य कोशिकाओं नाड़ी के लिए उपयोग किया जाता है. प्रत्येक पेप्टाइड पीबीएस ऐसे में था 2x अंतिम एकाग्रता में किया जाता हैटी हर पेप्टाइड एकाग्रता 250 μl की एक न्यूनतम मात्रा है. पेप्टाइड शेयरों पूर्व एफटीए निर्माण करने के लिए तैयार है और समारोह में उल्लेखनीय कमी के बिना -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
    1. तैयारी स्टॉक MHC वर्ग मैं बाध्यकारी पेप्टाइड्स
    2. 2 माइक्रोन स्टॉक समाधान (2x 1 माइक्रोन) के लिए प्रत्येक पेप्टाइड मिलान के सर्वोच्च एकाग्रता की तैयारी
    3. क्रमानुसार MHC वर्ग मैं बाध्यकारी पेप्टाइड्स पतला: पीबीएस के 400 μl में 2 माइक्रोन पेप्टाइड शेयर समाधान के 44.4 μl जोड़ें. 5 तालिका में प्रत्येक पेप्टाइड एकाग्रता देने के लिए पतला शेयर समाधान के साथ इस दोहराएँ.
    4. तैयारी स्टॉक MHC वर्ग द्वितीय बाध्यकारी पेप्टाइड्स
    5. 800 माइक्रोन स्टॉक समाधान (2x 400 माइक्रोन) के लिए प्रत्येक पेप्टाइड मिलान के सर्वोच्च एकाग्रता तैयार करें.
    6. क्रमानुसार MHC वर्ग द्वितीय बाध्यकारी पेप्टाइड्स पतला: पीबीएस के 300 μl में 800 माइक्रोन पेप्टाइड समाधान के 150 μl जोड़ें. 5 तालिका में प्रत्येक पेप्टाइड एकाग्रता देने के लिए पतला शेयर समाधान के साथ इस दोहराएँ

2. मुक्त व्यापार समझौते की तैयारी

नोट: नीचे की प्रक्रिया 252 discernable सेल समूहों उत्पन्न करने के लिए 6 बार दोहराया 6 अलग सांद्रता (. यानी 42 सेल क्लस्टर) में 7 अलग पेप्टाइड epitopes साथ स्पंदित कोशिकाओं के शामिल एक मुक्त व्यापार समझौते के निर्माण की रूपरेखा. प्रत्येक दोहराने के भीतर, किसी भी मिलान (शून्य) के साथ स्पंदित नहीं एक सेल क्लस्टर, एक नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया है. एफटीए विश्लेषण के समय में एंटीबॉडी लेबलिंग द्वारा प्राप्तकर्ता कोशिकाओं से उनके भेदभाव की अनुमति के लिए मेजबान जानवरों से एक CD45 allotype अंतर है करने के लिए यह उपयोगी है. अन्यथा एफटीए (कदम 2.6 में वर्णित) इस उद्देश्य के लिए इस तरह के PKH-26 के रूप में अन्य रंगों के साथ लेबल किया जा सकता. आमतौर पर, मुक्त व्यापार समझौता तैयार करने की प्रक्रिया एक बैठक के दौरान समाप्त करने के लिए शुरू से ही किया जाता है.

  1. लेबल 42, 10 मिलीलीटर शंक्वाकार (उदाहरण के लिए 1 टेबल के रूप में) प्लास्टिक ट्यूबों 1-42 तली.
  2. कोशिकाओं की तैयारी
    1. प्लीहा और / या lymp पृथकचूहों से hnodes. एक 5 मिलीलीटर सिरिंज सवार के साथ चलनी pored एक 70 माइक्रोन के माध्यम से mashing द्वारा ऊतकों से एकल कक्ष निलंबन की तैयारी और एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं गिनती.
    2. (RPMI, या समकक्ष) 5% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) युक्त रोचेस्टर पार्क मेमोरियल संस्थान 1640 के 11.5 मिलीलीटर में 200 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल पर लिम्फोसाइटों Resuspend. नोट: यह कोशिकाओं से 3 डाई विषाक्तता को कम करने के लिए उच्च amine सामग्री के साथ एक बफर का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  3. केबल टीवी लेबलिंग
    नोट: कोशिकाओं शुरू केबल टीवी के 6 सांद्रता के साथ चिह्नित कर रहे हैं.
    1. अच्छी तरह से ट्यूब कई बार inverting द्वारा कोशिकाओं resuspend. ट्यूब के शीर्ष आधा गीला करने के लिए नहीं ख्याल रख रही है, 37-42 लेबल 10 मिलीलीटर ट्यूबों के 6 सेल निलंबन के 1.9 मिलीलीटर जोड़ें.
    2. केबल टीवी के साथ कोशिकाओं लेबल, ट्यूब टोपी हटाने और क्षैतिज ट्यूब रखना.
    3. ट्यूब के शीर्ष पर गैर गीला भाग पीबीएस के 83 μl जोड़ें, और यह करने के लिए स्टॉक केबल टीवी के 17 μl जोड़ने (टैब देखेंशेयर समाधान जो ट्यूब) को सौंपा गया है, जिसके लिए Le 2. नोट: एक गैर गीला ट्यूब डाई समाधान के साथ सेल निलंबन आंदोलन और सेल के समाधान के लिए समय से पहले मिश्रण को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है.
    4. ट्यूब टोपी और vortexing द्वारा जल्दी और अच्छी तरह से रंग के साथ सेल निलंबन मिश्रण.
    5. चरणों को दोहराएँ 2.3.2-2.3.4 तालिका 2 में वर्णित नामित ट्यूबों में केबल टीवी का शेयर समाधान के लिए.
    6. आर टी (20 डिग्री सेल्सियस) पर 5 मिनट की एक न्यूनतम के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
  4. CFSE लेबलिंग
    1. रंगीन टीवी की लेबलिंग के बाद, प्रत्येक ट्यूब 5% FCS युक्त RPMI के 5 मिलीलीटर जोड़ें और अच्छी तरह से vortexing द्वारा कोशिकाओं resuspend.
      1. ट्यूब ट्यूबों के लिए 37 स्थानांतरण सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर तक 31, 25, 19, 13, 7, और 1.
      2. ट्यूब ट्यूबों के लिए 38 स्थानांतरण सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर तक 32, 26, 20, 14, 8, और 2.
      3. ट्यूब ट्यूबों के लिए 39 स्थानांतरण सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर तक 33, 27, 21, 15, 9, और 3.
      4. सेल की ट्यूब में 40 स्थानांतरण 1 मिलीलीटर सेट्यूबों 34, 28, 22, 16, 10, और 4 को निलंबन.
      5. ट्यूब ट्यूबों के लिए 41 स्थानांतरण सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर तक 35, 29, 23, 17, 11, और 5.
      6. ट्यूब से 42 स्थानांतरण ट्यूबों 36, 30, 24, 18, 12, और 6 सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर
        नोट: कदम 2.4.1.1-2.4.1.6 दौरान ट्यूबों के शीर्ष आधा गीला करने के लिए नहीं ख्याल रखना.
    2. CFSE साथ कोशिकाओं लेबल, ट्यूब टोपी हटाने और क्षैतिज ट्यूब रखना.
    3. ट्यूब के शीर्ष पर गैर गीला भाग पीबीएस के 103 मिलीलीटर जोड़ें, और यह करने के लिए (शेयर समाधान जो ट्यूब को सौंपा है, जिसके लिए 3 टेबल देखें) शेयर CFSE के 7 मिलीलीटर जोड़ें.
    4. ट्यूब टोपी और vortexing द्वारा जल्दी और अच्छी तरह से रंग के साथ सेल निलंबन मिश्रण.
    5. तालिका 3 में वर्णित नामित ट्यूबों में CFSE के शेयर समाधान के लिए कदम 2.4.2-2.4.4 करो.
    6. आर टी (20 डिग्री सेल्सियस) पर 5 मिनट की एक न्यूनतम के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
    7. कोशिकाओं को धो लें: 20 डिग्री सेल्सियस के 9 मिलीलीटर के साथ सेल निलंबन पतलाRPMI युक्त 5% FCS, 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा तलछट और एक हस्तांतरण विंदुक के साथ आकांक्षा से supernatants हटा दें.
  5. पेप्टाइड स्पंदन और सेल धोने
    नोट: कोशिकाओं रंगीन टीवी और CFSE के साथ चिह्नित किया गया है, के बाद वे MHC वर्ग मैं और / या MHC वर्ग द्वितीय (1.2 में तैयार) बाध्यकारी पेप्टाइड्स के साथ स्पंदित कर रहे हैं. सेल आबादी में से एक भी (1 टेबल में जैसे. शून्य) पेप्टाइड के साथ स्पंदित और टी सेल प्रतिक्रिया की गणना के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए.
    1. पेप्टाइड स्पंदन
      1. 5% FCS युक्त RPMI के 250 μl की कुल मात्रा में कोशिकाओं Resuspend. नोट: आमतौर पर सेल निलंबन के 50 μl, कदम 2.4.7 के अंत में सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा के बाद बनी हुई है इसलिए गोली सेल माध्यम के 200 μl जोड़ें.
      2. उचित (1 टेबल के रूप में) ट्यूब नामित करने के लिए (5 तालिका के रूप में) पूर्व तैयार पेप्टाइड शेयरों की 250 μl जोड़ें और हो सुरपीबीएस के एक नियंत्रण ट्यूब शामिल करने के लिए ई एक शून्य नियंत्रण के रूप में पेप्टाइड के बिना अकेले गयी.
      3. एक भंवर के साथ सेल निलंबन मिलाएं. नोट: यह एक पेप्टाइड मिलान और प्रत्येक पेप्टाइड एकाग्रता एक ट्यूब और को सौंपा है महत्वपूर्ण है कि यह इस क्लस्टर के प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर तालिका में के रूप में (इस पेप्टाइड को परिभाषित करेगा के बाद से, इस ट्यूब में कोशिकाओं की उम्मीद प्रतिदीप्ति के आधार पर स्पष्ट रूप से दर्ज उदाहरण के लिए 1).
      4. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं.
    2. सेल धोने
      1. बर्फ ठंड के 5 एमएल (4 डिग्री सेल्सियस) RPMI ट्यूब inverting द्वारा सेल निलंबन और resuspend कोशिकाओं को 5% FCS युक्त जोड़ें. ध्यान से बर्फ के ठंडे (4 डिग्री सेल्सियस) एफसीएस के 3 मिलीलीटर के साथ सेल निलंबन बुनियाद.
      2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं तलछट एफसीएस के इंटरफेस सुनिश्चित करने के लिए धीमी गति त्वरण और ब्रेक लगाना का प्रयोग करें और सेल निलंबन समाधान बनाए रखा है.
      3. तो ध्यान RPMI बंद aspirate औरअबाधित धोया सेल छर्रों छोड़ने एक हस्तांतरण विंदुक के साथ FCS,. नोट: कोशिकाओं को धोने के लिए एक एफसीएस बुनियाद का उपयोग के रूप में ज्यादा पेप्टाइड समाधान संभव के रूप में कोशिकाओं से हटा दिया जाता है सुनिश्चित करने में मदद करता है और कोशिकाओं को जमा कर रहे हैं जब इस तरह कई मुफ्त पेप्टाइड्स के लिए सेल आबादी के जोखिम को सीमित.
      4. फिर कोशिकाओं को धो लें: 5% FCS युक्त 4 डिग्री सेल्सियस RPMI के 10 मिलीलीटर में सेल छर्रों Resuspend. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं तलछट Supernatants डालो.
      5. पूल सभी सेल एक साथ 5% FCS युक्त 4 डिग्री सेल्सियस RPMI के 6 मिलीलीटर का उपयोग कर एक विंदुक के साथ एक एकल ट्यूब में आबादी. तलछट 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं जमा एक हस्तांतरण विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला बंद aspirate.
  6. सीपीडी सेल लेबलिंग
    नोट: इस बिंदु पर छह इंट्रा परख replicates सीपीडी के 6 अलग सांद्रता के साथ लेबलिंग पेप्टाइड स्पंदित कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है.
    1. 20 डिग्री सेल्सियस से 11.4 मिलीलीटर जोड़ेंRPMI अच्छी तरह से एक पिपेट का उपयोग कर जमा सेल गोली और resuspend के लिए 5% FCS युक्त.
    2. ट्यूब के शीर्ष आधा गीला करने के लिए नहीं ख्याल रख रही है, 10 मिलीलीटर ट्यूबों वायुसेना लेबल, 6 सेल निलंबन के 1.9 मिलीलीटर जोड़ें.
    3. सीपीडी के साथ कोशिकाओं लेबल, ट्यूब टोपी हटाने और क्षैतिज ट्यूब रखना.
    4. ट्यूब के शीर्ष पर गैर गीला भाग पीबीएस के 92 μl जोड़ें, और यह करने के लिए (प्रत्येक ट्यूब को सौंपा शेयर समाधान की मात्रा के लिए 4 तालिका देखें) शेयर सीपीडी जोड़ें.
    5. ट्यूब टोपी और vortexing द्वारा जल्दी और अच्छी तरह से रंग के साथ सेल निलंबन मिश्रण.
    6. . CFSE और केबल टीवी के विपरीत, सीपीडी लेबलिंग एकाग्रता ठीक रैखिक लेबल की कोशिकाओं के परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति तीव्रता से संबंधित नहीं है, और: तालिका 4 में वर्णित नामित ट्यूबों में सीपीडी के शेयर समाधान के लिए कदम 2.6.3-2.6.5 नोट करो इसलिए कई लेबल आबादी के समान दूरी पर फ्लोरोसेंट चोटियों प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया लेबलिंग एकाग्रता की गई है(4 तालिका देखें) empirically निर्धारित.
    7. आर टी (20 डिग्री सेल्सियस) पर 5 मिनट की एक न्यूनतम के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
    8. दो बार कोशिकाओं को धो लें: Resuspend कोशिकाओं 10 मिलीलीटर के लिए 20 डिग्री सेल्सियस RPMI 5% FCS को रोकने के साथ. 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं तलछट एक हस्तांतरण विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला बंद aspirate. दोहराएँ.
    9. पूल एक साथ एक विंदुक के साथ 5% FCS युक्त 8 मिलीग्राम 4 डिग्री सेल्सियस RPMI का उपयोग कर एक ट्यूब में सभी कोशिकाओं. तलछट 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं जमा और एक हस्तांतरण विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला बंद aspirate.
  7. (वैकल्पिक) PKH-26 सेल लेबलिंग
    नोट: एफटीए चूहों की मेजबानी के लिए एक CD45 allotypic अंतर व्यक्त कोशिकाओं के साथ निर्माण नहीं किया जा सकता है, वे प्राप्तकर्ता कोशिकाओं से उनके भेदभाव की अनुमति के लिए PKH-26 के साथ लेबल किया जा सकता है.
    1. जमा सेल गोली 2.9 20 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के मिलीलीटर जोड़ें और एक विंदुक के साथ अच्छी तरह से resuspend.
    2. एक नहीं करने के लिए सेल निलंबन जोड़ेंn ट्यूब के शीर्ष आधा गीला करने के लिए नहीं ख्याल रख रही है, 10 मिलीलीटर ट्यूब गीला.
    3. ट्यूब टोपी निकालें और क्षैतिज ट्यूब रखना.
    4. ट्यूब के शीर्ष पर गैर गीला हिस्से को (PKH-26 डाई किट में) मंदक सी के 58 μl जोड़ें, और यह करने के लिए 1 मिमी शेयर PKH-26 के 42 μl जोड़ें.
    5. ट्यूब टोपी और अच्छी तरह से vortexing द्वारा डाई के साथ सेल समाधान मिश्रण.
    6. आर टी (20 डिग्री सेल्सियस) पर 10 मिनट की एक न्यूनतम के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
    7. दो बार कोशिकाओं को धो लें: Resuspend कोशिकाओं 10 मिलीलीटर के लिए 20 डिग्री सेल्सियस RPMI 5% FCS को रोकने के साथ. 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं तलछट एक हस्तांतरण विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला बंद aspirate. दोहराएँ.
  8. मेजबान पशुओं में एफटीए इंजेक्शन लगाने
    नोट: विवो में टी सेल प्रतिक्रिया को मापने के लिए, एफटीए एक सक्रिय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है और अप करने के लिए 24 घंटे के लिए बगल में छोड़ दिया है कि पशुओं में इंजेक्ट किया जाता है. यह एफटीए भी एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक भोले जानवर में इंजेक्ट कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है.
    1. गणना और पीबीएस में मिलीलीटर प्रति 2.5 x 10 8 कोशिकाओं में कोशिकाओं resuspend. एक नियंत्रण के रूप में एक भोले पशु सहित, नसों मेजबान चूहों में कोशिकाओं के 200 μl इंजेक्षन.

3. फ्लो

  1. एफटीए इंजेक्शन फसल रक्त या तिल्ली (या हित के अन्य ऊतकों) मेजबान चूहों से बाद 18-24 घंटा.
  2. एक 70 माइक्रोन के माध्यम से mashing द्वारा ऊतकों से एकल कक्ष निलंबन की तैयारी एक 5 मिलीलीटर सिरिंज सवार के साथ चलनी pored.
  3. 0.1% BSA युक्त पीबीएस में ऊपर से 65 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल में कोशिकाओं Resuspend.
  4. एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए एक microtitre थाली के कुओं में सेल निलंबन के 100 μl aliquots बांटना.
  5. CFSE, रंगीन टीवी और सीपीडी को प्रेतसंबंधी संगत प्रतिदीप्ति साथ fluorochrome लेबल एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट व्यवहार्यता की जांच के साथ लेबल कोशिकाओं. नोट: इस तरह B220 और ऐसे CD69 के रूप में सक्रियण मार्कर के रूप में सेल मार्कर बी के लिए एंटीबॉडी एफटी का उपयोग अगर बी सेल सक्रियण को मापने के लिए आवश्यक हैंएक टी एच सेल प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए 2. एफटीए और मेजबान चूहों एक CD45 allotypic फर्क है अगर CD45.1 और / या CD45.2 के लिए एक एंटीबॉडी शामिल करें.
  6. अच्छा मिश्रण है और 30 मिनट के लिए बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर सेते हैं, कोशिकाओं की 100 μl aliquots के लिए (0.1% BSA युक्त पीबीएस में) एंटीबॉडी / व्यवहार्यता रंगों का 2x स्टॉक समाधान के 100 μl जोड़ें.
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा तलछट कोशिकाओं और सतह पर तैरनेवाला निकालें: कोशिकाओं को धो लें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा 200 0.1% BSA युक्त पीबीएस के μl, तलछट की कोशिकाओं में कोशिकाओं Resuspend और सतह पर तैरनेवाला हटायें.
  8. एक 70 माइक्रोन जाल के माध्यम से 0.1% बीएसए, फिल्टर युक्त कोशिकाओं और प्रासंगिक फ्लोरोसेंट रंगों और conjugates पता लगाने में सक्षम एक प्रवाह cytometer में प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण पीबीएस के 400 μl की कुल मात्रा में कोशिकाओं Resuspend. प्रत्येक एफटीए सेल क्लस्टर हल करने के लिए 3 एक्स 10 6 लिम्फोसाइट घटनाओं को ऊपर ले लीजिए और statisti के लिए पर्याप्त कोशिकाओं लाभकैलोरी विश्लेषण. नोट: प्रवाह के लिए (जैसे एक दाग नियंत्रण के रूप में) सभी ठेठ नियंत्रण सुनिश्चित cytometry कार्यरत हैं. आमतौर पर, CFSE एक नीले लेजर स्रोत (आमतौर पर 488 एनएम) और 520 एनएम पर केन्द्रित बैंड पास फिल्टर के साथ पता लगाने से उत्तेजना की आवश्यकता है; केबल टीवी एक बैंगनी लेजर स्रोत (आमतौर पर 405 एनएम) और 450 एनएम पर केन्द्रित बैंड पास फिल्टर के साथ पता लगाने से उत्तेजना की आवश्यकता है; और सीपीडी एक लाल लेजर स्रोत (आमतौर पर 633 एनएम या 640 एनएम) और 670 एनएम पर केन्द्रित बैंड पास फिल्टर के साथ पता लगाने से उत्तेजना की आवश्यकता है.

4. डेटा विश्लेषण

  1. मानक फ्लो सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा प्रवाह cytometry विश्लेषण (कार्यरत gating रणनीति के प्रकार का एक उदाहरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम देखें).
  2. % विशिष्ट मारने के लिए, MHC वर्ग मैं बाध्यकारी पेप्टाइड्स और ("शून्य") स्पंदित पेप्टाइड नहीं थे कि मुक्त व्यापार समझौते समूहों के साथ स्पंदित प्रत्येक एफटीए सेल क्लस्टर में कोशिकाओं की संख्या की गणना और गणना करने के लिए निम्न सूत्र का उपयोग% विशिष्ट हत्या.
    % विशिष्ट हत्या सूत्र
    नोट: "primed" ऊपर सूत्र "भोले" "पेप्टाइड" पेप्टाइड और "शून्य" के साथ स्पंदित लक्ष्य को संदर्भित करता है, भोले जानवरों से लक्ष्य को संदर्भित करता है, लक्ष्य पेप्टाइड्स के खिलाफ एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है लगा रहे हैं कि जानवरों से लक्ष्य को दर्शाता है किसी भी पेप्टाइड्स के साथ स्पंदित नहीं लक्ष्यों को दर्शाता है.
  3. बी सेल सक्रियण के लिए टी एच गतिविधि का एक उपाय के रूप में, के GMFI घटाना "primed" पशुओं में MHC वर्ग द्वितीय बाध्यकारी पेप्टाइड्स के साथ और इस से स्पंदित एफटीए बी कोशिकाओं पर CD69 एंटीबॉडी प्रतिदीप्ति के ज्यामितीय मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (GMFI) की गणना टी एच गतिविधि का एक उपाय देने के लिए "भोले" पशुओं में इसी एफटीए बी कोशिकाओं पर CD69 अभिव्यक्ति.
  4. कदम 4.2 और 4.3, उपयोग में उत्पन्न आँकड़ों सेऐसी अवस्था और चुनाव आयोग 50 के तहत क्षेत्र (इन गणनाओं नीलामी के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं कि कैसे एक गहराई में विवरण के रूप में अन्य मात्रात्मक और गुणात्मक मापदंडों की गणना करने के लिए इस तरह के GraphPad चश्मे के रूप में गणितीय स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में पाया जा सकता है
    http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm, और EC50 के लिए: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index. htm? reg_the_ec50.htm).

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Representative Results

एफटीए परख के उपयोग का एक उदाहरण के रूप में, एक BALB / ग माउस एचआईवी मैं सीटीएल epitopes को एचआईवी मैं epitopes (वी.वी. एचआईवी) और प्रतिक्रियाओं को व्यक्त पुनः संयोजक चेचक वायरस (वी.वी.) के साथ प्रतिरक्षित किया गया था, झूठ, झूठ MUT, पर्यावरण और पोल, वी.वी. सीटीएल epitopes F2L और F2L MUT, और एचआईवी मैं टी एच सेल का मिलान, चुप गु (2 में वर्णित है) एक 252 पैरामीटर एफटीए परख (चित्रा 1 बी) का उपयोग मूल्यांकन किया गया. झूठ (झूठ MUT) और F2L (F2L MUT) का मिलान वेरिएंट वी.वी. एचआईवी वेक्टर में व्यक्त किया है और इसलिए इन epitopes के खिलाफ प्रतिक्रियाओं का मिलान संस्करण पार प्रतिक्रियाशील टी सेल प्रतिक्रिया को प्रतिबिंबित करता है नहीं कर रहे हैं. भोले चूहों भी एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में मुक्त व्यापार समझौते के साथ इंजेक्शन थे. एफटीए फ्लो (आंकड़े 1 ए और 1 बी) के माध्यम से B220 एंटीबॉडी धुंधला द्वारा भेदभाव PKH-26 लेबलिंग और मुक्त व्यापार समझौते बी कोशिकाओं द्वारा होस्ट चूहे की कोशिकाओं से भेदभाव किया गया था. 6 इंट्रा पशु replicates से प्रत्येक सीपीडी प्रतिदीप्ति (चित्रा 1C पर आधारित gated गया था (चित्रा -1) पर आधारित gated epitopes के विभिन्न सांद्रता व्यक्त एफटीए लक्ष्य. प्रत्येक को दोहराने का% विशिष्ट किलिंग भोले जानवरों (चित्रा -1) में एफटीए समूहों इसी के सापेक्ष primed पशुओं में मुक्त व्यापार समझौते क्लस्टर कोशिका मृत्यु की तुलना द्वारा मूल्यांकन किया गया था. टी एच गतिविधि भोले जानवरों (चित्रा 1E) में एफटीए बी सेल समूहों इसी के सापेक्ष primed पशुओं में CD69 के मुक्त व्यापार समझौते बी सेल upregulation तुलना द्वारा मूल्यांकन किया गया था.

इस विश्लेषण से, वी.वी. एचआईवी संक्रमण 0.001 मिमी या तिल्ली (2A चित्रा) से हटाया जा रहा है मिलान के अधिक से स्पंदित एफटीए लक्ष्य कोशिकाओं के 100% के साथ, immunodominant वी.वी. मिलान F2L के खिलाफ मजबूत सीटीएल प्रतिक्रियाओं उत्पन्न. 0.01 मिमी या तिल्ली से हटाया जा रहा है मिलान के अधिक से स्पंदित एफटीए लक्ष्य कोशिकाओं के 100% के साथ F2L के संस्करण प्रपत्र, F2L MUT, उत्पन्न के खिलाफ एक मजबूत प्रतिक्रिया भी हुई थी. के बाद सेF2L MUT संक्रमित वायरस में मौजूद नहीं है, यह प्रतिक्रिया एक मिलान संस्करण पार प्रतिक्रियाशील प्रतिक्रिया इंगित करता है. एचआईवी चुप मिलान व्यक्त लक्ष्य के विरुद्ध उत्पन्न एक अपेक्षाकृत उदारवादी प्रतिक्रिया और इस मिलान, एचआईवी चुप MUT के संस्करण प्रपत्र के खिलाफ एक मामूली पार प्रतिक्रियाशील प्रतिक्रिया भी हुई थी. एचआईवी पोल और एचआईवी लि सीटीएल epitopes को उत्पन्न नगण्य प्रतिक्रियाओं होना को दिखाई दिया.

सीटीएल प्रतिक्रियाओं के अलावा, दिखाया एफटीए उदाहरण परख भी एचआईवी MHC वर्ग द्वितीय बाध्यकारी मिलान एचआईवी चुप गु (चित्रा 2B) व्यक्त एफटीए बी सेल की सक्रियता का आकलन करने से टी एच प्रतिक्रियाओं को मापा. इस विशिष्ट प्रतिजन बी सेल सक्रियण एचआईवी चुप गु विशेष टी एच सेल effectors की पीढ़ी सुझाव primed पशुओं में हुई देखी गई.

टी सेल प्रतिक्रिया परिमाण के इन उपायों epitopes के प्रत्येक (चित्रा -2) है कि विदेश मंत्रालय के लिए वक्र मूल्यों (नीलामी) के तहत क्षेत्र द्वारा पैदा संक्षेप किया जा सकता हैप्रतिक्रिया की संचयी परिमाण उपायों.

विशिष्ट प्रतिजन और मिलान संस्करण पार प्रतिक्रियाशील प्रतिक्रियाओं के परिमाण के अलावा, मुक्त व्यापार समझौते परख कार्यात्मक उत्सुकता माप किए जाने के लिए अनुमति देता है. उदाहरण के लिए, आधा अधिक से अधिक प्रतिक्रियाओं (ईसी 50) देने के लिए आवश्यक एफटीए लक्ष्य कोशिकाओं नाड़ी के लिए इस्तेमाल किया प्रभावी पेप्टाइड सांद्रता, सीटीएल प्रभावोत्पादक (चित्रा 2 डी) के लिए दिखाया गया है. यह प्रमुख वी.वी. मिलान F2L को उत्पन्न प्रतिक्रियाओं से, क्रमश: लगभग 10, 100 और 4,000 गुना कम थे, epitopes F2L MUT, एचआईवी चुप और एचआईवी चुप MUT तक कार्यात्मक उत्सुकता देखी गई.

तालिका 1
तालिका 1. 6 एडवेंचर्स में 7 अलग पेप्टाइड epitopes साथ स्पंदित 42 नमूने / ट्यूब के शामिल एक 252 मुक्त व्यापार समझौते के एक दोहराने की 252 पैरामीटर एफटीए. विशिष्ट लेआउट का लेआउटएक संयुक्त राष्ट्र स्पंदित (शून्य) नमूना सहित टी सांद्रता और. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

ट्यूब संख्या वॉल्यूम (μl) डाई शेयर (मिमी केबल टीवी) अंतिम एकाग्रता (माइक्रोन)
37 0 0 0
38 17 0.053 0.451
39 17 0.197 1.48
40 17 0.73 6.21
41 17 2.7 23
42 17 10 85

सूचीबद्ध की तालिका 2. केबल टीवी के शेयरों कोशिकाओं लेबल इस्तेमाल किया. वॉल्यूमकेबल टीवी के शेयर अंतिम लेबलिंग डाई एकाग्रता देने के लिए 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं लेबल इस्तेमाल किया.

ट्यूब संख्या वॉल्यूम (μl) डाई शेयर (मिमी CFSE) अंतिम एकाग्रता (माइक्रोन)
37-42 0 0 0
31 - 36 7 0.022 0.139
25 - 30 7 0.078 0.492
19 - 24 7 0.23 1.45
13 - 18 7 0.82 5.17
7 - 12 7 2.9 18.3
1 - 6 7 10 63.1

सूचीबद्ध CFSE स्टॉक हमें की तालिका 3. CFSE शेयरों कोशिकाओं लेबल इस्तेमाल किया. वॉल्यूमअंतिम लेबलिंग डाई एकाग्रता देने के लिए 1.11 मिलीलीटर में कोशिकाओं लेबल एड.

ट्यूब संख्या वॉल्यूम (μl) डाई शेयर (मिमी सीपीडी) अंतिम एकाग्रता (माइक्रोन)
एक 0 0 0
बी 4 0.053 0.106
सी 6.3 0.197 0.62
डी 7.5 0.73 2.74
ए 7.3 2.7 9.86
एफ 7.7 10 38.5

अंतिम labelin देने के लिए 2 मिलीलीटर में लेबल कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल सूचीबद्ध सीपीडी शेयर की तालिका 4. सीपीडी शेयरों कोशिकाओं लेबल इस्तेमाल किया. वॉल्यूमजी डाई एकाग्रता.

पेप्टाइड एकाग्रता (माइक्रोन)
MHC वर्ग मैं बाध्यकारी पेप्टाइड्स 0 0.00002 0.0002 0.002 0.012 0.2 2
MHC वर्ग द्वितीय बाध्यकारी पेप्टाइड्स 0 3.29 9.88 29.6 88.9 266 800

सारणी 5. MHC वर्ग मैं और द्वितीय बाध्यकारी पेप्टाइड शेयर सांद्रता. ठेठ स्टॉक सांद्रता एक मुक्त व्यापार समझौते 1 निर्माण किया पेप्टाइड epitopes के 1. इन सांद्रता लक्ष्य कोशिकाओं नाड़ी के लिए इस्तेमाल किया अंतिम सांद्रता 2x रहे हैं.

चित्रा 1 एफटीए के cytometry विश्लेषण चित्रा 1. विशिष्ट प्रवाह. Splenocytes BALB / ग चूहों से पाठ में वर्णित के रूप में एक 252 पैरामीटर मुक्त व्यापार समझौते के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया. (5 तालिका में सूचीबद्ध) एफटीए समूहों MHC वर्ग मैं बाध्यकारी epitopes, F2L (SPYAAGYDL, एक एल डी प्रतिबंधित चेचक वायरस (वी.वी.) मिलान) सहित 7 विभिन्न वायरल epitopes के 6 सांद्रता के साथ स्पंदित कर रहे थे; F2L MUT (सपा जी AAGYDL, F2L का एक प्रकार), चुप (AMQMLKETI, एक कश्मीर डी प्रतिबंधित एचआईवी चुप मिलान 4), चुप MUT (AMQMLK डी तिवारी, एचआईवी चुप 5 का एक प्रकार), पीओएल (VGPTPVNII, एक डी डी प्रतिबंधित एचआईवी पीओएल मिलान 6), लि (RGPGRAFVTI, एक डी डी प्रतिबंधित एचआईवी वातावरण मिलान 7); और MHC वर्ग द्वितीय बाध्यकारी पेप्टाइड चुप टी एच (PVGEIYKRWIILGLN, एक एच 2 डी प्रतिबंधित एचआईवी चुप मिलान 4). एफटीए चतुर्थ इंजेक्शन थे. 6 दिन पहले आरईसी के साथ (में). intranasally संक्रमित किया गया था कि एक BALB / ग माउस मेंएचआईवी epitopes (वी.वी. एचआईवी, primed जानवर) व्यक्त ombinant वी.वी.. एफटीए भी एक नियंत्रण के रूप में भोले चूहों में इंजेक्ट किया गया था. विवो में 18 घंटे के बाद, मेजबान चूहों से splenocyte निलंबन में मौजूद एफटीए कोशिकाओं प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया. ए (यह भी करने के लिए उपयोगी है लिम्फोसाइटों, singlets और PKH-26 + मुक्त व्यापार समझौते की कोशिकाओं के लिए द्वार दिखा एफटीए कोशिकाओं की पहचान करने के लिए) विशिष्ट प्रगतिशील gating रणनीति दिखा 6 इंट्रा जानवर के प्रत्येक replicates अंकन एफटीए सीपीडी प्रतिदीप्ति दिखा भोले मेजबान माउस से सभी एफटीए समूहों दिखा Hoechst 33258 की तरह एक व्यवहार्यता डाई का उपयोग जीवित कोशिकाओं को हल,) नहीं दिखाया गया है. बी) 3 डी साजिश है. सी) हिस्टोग्राम भूखंडों. डी) 2 डी भूखंडों 6 इंट्रा पशु मुक्त व्यापार समझौते बी सेल के एक भोले और primed पशु से अलग अलग प्रकार के और epitopes की सांद्रता पेश replicates. इस "हत्या की घटनाओं" खुलासा, भोले जानवर के लिए primed पशु सापेक्ष में मुक्त व्यापार समझौते कोशिकाओं के अभाव से पता चलता हैएफटीए टी सहायक परख 2 के ठिकानों रूपों जो जानवरों भोले के सापेक्ष primed पशुओं में सक्रियण मार्कर CD69 के मुक्त व्यापार समझौते बी सेल अभिव्यक्ति की एफटीए परख 1 की मौत हो गई. ई) हिस्टोग्राम विश्लेषण के आधार फार्म कि CTLs द्वारा. यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

चित्रा 2
चित्रा 2. एफटीए विवो में टी सेल प्रतिक्रिया की भयावहता और उत्सुकता का माप सक्षम. एक 252 पैरामीटर एफटीए चित्र 1 में वर्णित के रूप में वी.वी. एचआईवी से संक्रमित चूहों में टी सेल प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. ए)% विशिष्ट हत्या गणना की गई 6 पुनः में से प्रत्येक से सभी सीटीएल epitopes और परिणामों के लिए(बाएं पैनल) के रूप में अच्छी तरह से मतलब है और इसका मतलब है की मानक त्रुटि (सही पैनल) में दिखाया गया. बी) टी एच प्रतिक्रिया दिखाया plicates एफटीए बी कोशिका (6 इंट्रा पशु replicates में से प्रत्येक के लिए एचआईवी चुप गु मिलान पेश की सक्रियता को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया गया था % विशिष्ट हत्या (एक) और टी सहायक प्रतिक्रियाओं के लिए बाएं पैनल) और साधन और साधन की मानक त्रुटि (सही पैनल) की गणना की. सी) नीलामी माप (ख)) संचयी परिमाण का एक उपाय. डी के रूप में गणना की गई चुनाव आयोग 50 माप गणना की गई है % विशिष्ट हत्या डेटा के लिए (एक) कार्यात्मक उत्सुकता का एक उपाय के रूप में. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

एफटीए आधारित assays का लाभ वे प्रवाह cytometry द्वारा एक भी मेजबान जानवर से> 250 व्यवहार्य और पूरी तरह कार्यात्मक लक्ष्य सेल आबादी के भेदभाव की अनुमति है. इस से पहले संभव नहीं हो पाया है कि vivo में फ्लो आधारित assays के लिए जटिलता का एक स्तर प्रदान करता है. यह 6 सांद्रता में 7 अलग वायरल epitopes के लिए प्रतिक्रियाओं ऐसे नीलामी और चुनाव आयोग के रूप में 50 मापदंडों विवो में टी सेल प्रतिक्रिया के लिए निर्धारित करने की अनुमति एक भी पशु में एक साथ 6 की प्रतिकृति में नजर रखी जा सकता है, जहां ऊपर दिखाए 2 पशु प्रयोगों में प्रकाश डाला है .

विवो में टी सेल प्रतिक्रिया को मापने के अलावा, मुक्त व्यापार समझौते आधारित assays विट्रो 1 में प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए संशोधित किया जा सकता है. यह अनिवार्य रूप से इन विट्रो में कई घंटे से अधिक प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए संस्कृति में टी कोशिकाओं एफटीए जोड़ने शामिल है. एफटीए का उपयोग इन विट्रो आधारित assays के लिए एक संभावित सीमा टी हैआसपास की कोशिकाओं 1, 3 के लिए लेबलिंग डाई हस्तांतरण करने के लिए मुक्त व्यापार समझौते के भीतर लेबल की कोशिकाओं के लिए वह प्रवृत्ति. उनके प्रतिदीप्ति प्रत्येक आबादी के बीच कम अलग हो जाता है के रूप में यह मुक्त व्यापार समझौते सेल समूहों के कम संकल्प में परिणाम कर सकते हैं. कोशिकाओं में इन विट्रो assays में समय की लंबी अवधि के लिए करीब निकटता में हैं क्योंकि यह vivo में assays की तुलना में इन विट्रो assays में अधिक स्पष्ट है. एफटीए सेल आबादी के संकल्प में यह नुकसान effector टी कोशिकाओं के साथ और उनके बीच "फ्लोरोसेंट अंतरिक्ष" की एक बड़ी राशि है कि एक कम लक्ष्य सेल आबादी है कि एफटीए का उपयोग करके एफटीए की संस्कृति के समय को कम करने से इन विट्रो assays में कम से कम किया जा सकता है तो कि डाई हस्तांतरण कम प्रभाव पड़ता है.

एफटीए 48 घंटा 1 के लिए vivo में रखा गया था जब हम भी मुक्त व्यापार समझौते सेल आबादी के संकल्प में नुकसान का उल्लेख किया है. यह मुक्त व्यापार समझौते prolife भीतर लक्ष्य बी कोशिकाओं का परिणाम हो दर्शनरेटिंग और इस तरह डाई प्रतिदीप्ति तीव्रता को कम करने. यह संभावना बी सेल उत्तेजना के परिणामस्वरूप प्रतिजन विशेष प्रेरक सीडी 4 + टी कोशिकाओं को आत्मीय प्रतिजन बी कोशिकाओं का एक परिणाम है. इसलिए यह परख ~ 24 घंटा या उससे कम बी सेल लक्ष्य पर नजर रखी जा रही हैं करने के लिए जब सीमित किया जा सिफारिश की है.

एकाधिक (> 96) अद्वितीय सेल समूहों लेबल करने की क्षमता fluorescently पहले से तय अलाभकारी कोशिकाओं 8 का उपयोग कर सूचना दी गई है. जीवित कोशिकाओं का धुंधला हो जाना, तथापि, संगत महत्वपूर्ण रंगों की उपलब्धता के साथ अधिक समस्याग्रस्त किया गया है, और केवल 8-12 व्यवहार्य कोशिकाओं समूहों 9 पहले से हासिल किया गया है. यहां बताया> 250 अनोखे fluorescently लेबल व्यवहार्य और कामकाज कोशिकाओं को उत्पन्न करने की क्षमता, CFSE की तरह महत्वपूर्ण रंगों के गुणों पर निर्भर करता है. , जैसे कि रंगीन टीवी और सीपीडी के रूप में, इन रंगों के कई केवल हाल ही में उपलब्ध हो गए हैं. इन रंगों के सक्षम होने के लक्षण हैंएक उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ कोशिकाओं लेबलिंग, कि लंबी और कम विचरण 3 का रहता है. लेबलिंग और लेबल की कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए इस्तेमाल डाई की एकाग्रता के बीच (विशेष रूप से CFSE और केबल टीवी के मामले में) एक रेखीय रिश्ता है कि इस तथ्य के साथ मिलकर इन गुणों, कोशिकाओं (कई के साथ लेबल किया जा सकता है 7 को आसानी फ्लो द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है कि हर रंग की) तीव्रता यहाँ दिखाया गया है. इसके अलावा, CFSE की प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के बाद से, सीपीडी और रंगीन टीवी की न्यूनतम वर्णक्रमीय ओवरलैप है, वे इस प्रकार अप करने के लिए> 250 फ्लोरोसेंट सेल हस्ताक्षर प्रवाह cytometry द्वारा पता लगाया जा करने की अनुमति है, कोशिकाओं लेबल संयोजन में उपयोग किया जा सकता है. यह discernable फ्लोरोसेंट हस्ताक्षर की इस संख्या के साथ कोशिकाओं की लेबलिंग को प्राप्त करने के क्रम में, यह सेल लेबलिंग तेजी से किया जाता है कि महत्वपूर्ण है कि ध्यान दिया जाना चाहिए 10, 11 (कम प्रतिदीप्ति विचरण उत्पन्न करने के लिए) और युक्त एक उपयुक्त बफर मेंमुफ्त amines 3 (अन्यथा उच्च सांद्रता में इन रंगों के साथ हो सकता है जो डाई विषाक्तता बफर करने के लिए). यह घटना प्रतिदीप्ति में है कि गलत उतार चढ़ाव प्रवाह cytometry द्वारा एफटीए के अधिग्रहण के दौरान (CFSE, रंगीन टीवी और / या समय के साथ सीपीडी प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के द्वारा उदाहरण के लिए) निगरानी कर रहे हैं कि यह भी महत्वपूर्ण है. मशीन की वजह से कर रहे हैं कि घटना प्रतिदीप्ति में इस तरह के उतार चढ़ाव त्रुटियों बारी में टी सेल effector समारोह के अंतिम उपायों में त्रुटियों में परिणाम हो सकता है कि सही लक्ष्य सेल क्लस्टर स्थिति के अशुद्ध अर्थ में हो सकता है शुरू की है क्योंकि यह महत्वपूर्ण है. शुरू की त्रुटियों cytometer इस तरह के प्रवाह उच्च गुणवत्ता के नमूने तैयार (विशेष रूप से बड़े सेल समुच्चय द्वारा प्रवाह cytometer में fluidic लाइनों का रोड़ा कम करने के लिए एक 70 माइक्रोन जाल के माध्यम से कोशिकाओं को छानने के लिए ध्यान दे) और प्रवाह cytometer को बनाए रखा है कि कर रहे हैं सुनिश्चित करने के द्वारा सीमित किया जा सकता है एक उच्च मानक.

विवो में टी सेल प्रतिक्रिया का मापनविवो 12 में लक्ष्य कोशिकाओं मौत नजर रखने के लिए इस तरह के CFSE के रूप में महत्वपूर्ण रंगों का उपयोग कर कई वर्षों के लिए किया गया है. आमतौर पर इन assays, हालांकि, एक बार में 13 और इसलिए सामान्य रूप से एक विस्तृत मूल्यांकन के उत्पन्न करने के लिए आवश्यक हैं कि कई epitopes के कई सांद्रता व्यक्त लक्ष्य की हत्या का आकलन करने के लिए एक सीमित क्षमता प्रदान 7-8 अलग लक्ष्य कोशिकाओं अप करने के लिए निगरानी की ही सक्षम किया गया है इस तरह के टी सेल प्रतिक्रिया के कार्यात्मक उत्सुकता के रूप में मानकों. इस संबंध में, टेट्रामर हदबंदी assays के हौसले से अलग effector टी कोशिकाओं 14-16 से टी सेल उत्सुकता का एक उपाय प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस तकनीक, हालांकि, MHC / TCR बंधन उत्सुकता के उपाय, और इसलिए भी प्रतिरक्षाविज्ञानी synapse की संरचना में परिवर्तन और टी सेल संकेत घटकों 17 की स्थिति पर निर्भर कर सकता है जो कार्यात्मक उत्सुकता का एक पूरा प्रतिबिंब नहीं है. इसलिए, आदर्श, कार्यात्मक उत्सुकता प्रदर्शन किया जा खुराक प्रतिक्रिया प्रयोगों की आवश्यकता है. यहपहले इस तरह के 51 करोड़ रिलीज परख, intracellular साइटोकाइन धुंधला परख 18, 19 या ELISPOT परख 20, 21 के रूप में इन विट्रो तकनीक का उपयोग कर पूरा किया गया है. इन तकनीकों में, हालांकि, कई बार जनसंख्या 22 के समग्र कार्यात्मक उत्सुकता को बदल सकते हैं, जो इन विट्रो में प्रेरित करने की effector टी कोशिकाओं की आवश्यकता होती है. एफटीए assays, इसलिए, एक साथ कई epitopes के खिलाफ वास्तविक समय में बगल में सीडी 4 + टी सेल और सीडी 8 + टी सेल खुराक प्रतिक्रियाओं को मापने के मौजूदा तकनीक के साथ सुधार, और इसलिए टी सेल को मापने के लिए मौजूदा तकनीक के लिए एक मूल्यवान इसके अतिरिक्त प्रदान करने देता है effector समारोह. हम एफटीए प्रौद्योगिकी का उपयोग ऐसे एचआईवी -1 और हेपेटाइटिस सी के खिलाफ निर्देशित टीके के रूप में उच्च गुणवत्ता टी सेल प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए डिज़ाइन किया गया स्क्रीनिंग immunotherapy रणनीतियों में मूल्यवान बन सकता है कि आशा

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

यह काम परियोजना अनुदान # 1010395 (BQ और सीपी) और # 525431 (सीआर), और ऑस्ट्रेलिया, हेपेटाइटिस और एचआईवी विषाणु विज्ञान ईओआई के लिए एक ऑस्ट्रेलियाई केन्द्र के राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद से एक कार्यक्रम अनुदान # 455395 (सीपी) द्वारा समर्थित किया गया 2012 अनुदान (सीआर और RJJ) और गॉर्डन और Gretel बूटेस फाउंडेशन (BQ और सीआर) से अनुदान. हम JCSMR FACS प्रयोगशाला की उनकी उत्कृष्ट रखरखाव के लिए हरप्रीत वोहरा और माइकल Devoy शुक्रिया अदा करना चाहता, पेप्टाइड संश्लेषण के लिए ऑस्ट्रेलियाई कैंसर रिसर्च फाउंडेशन Biomolecular संसाधन की सुविधा, JCSMR, अनु,, और डॉ. डेविड बॉयल, सीएसआईआरओ पशु स्वास्थ्य प्रयोगशालाओं, जिलॉन्ग, ऑस्ट्रेलिया माता - पिता एचआईवी टीके के शेयरों को उपलब्ध कराने के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI Sigma R8758
Fetal calf serum Serana FCS-500
CTV Invitrogen C34557
CFDA, SE Invitrogen C1157
CPD eBioscience 65-0840-90
anti-B220 PerCp-Cy5.5 eBioscience 110730
anti-CD69 brilliant violet 605 Biolegend 104529
PKH-26 Sigma PKH26GL-1KT
Vortex Scientific Industries Inc
Centrifuge Eppendorf
Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) BD Bioscience

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References

  1. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
  2. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo. J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).
  3. Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).
  4. Mata, M., Paterson, Y. Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens. J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).
  5. Earl, P. L., et al. Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines. Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).
  6. Wild, J., et al. Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model. Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).
  7. Takeshita, T., et al. Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule. J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).
  8. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3, 361-368 (2006).
  9. Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry. Cytometry A. 75, 440-449 (2009).
  10. Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. , (2010).
  11. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
  12. Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. , (2010).
  13. Hermans, I. F., et al. The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo. J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).
  14. Busch, D. H., Pamer, E. G. T cell affinity maturation by selective expansion during infection. J Exp Med. 189, 701-710 (1999).
  15. Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response. Immunity. 10, 485-492 (1999).
  16. Wang, X. L., Altman, J. D. Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays. J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).
  17. von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells. Clin Dev Immunol. , (2012).
  18. Prussin, C., Metcalfe, D. D. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).
  19. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2007).
  20. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).
  21. Klinman, D. ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells. Curr Protoc Immunol. , (2008).
  22. Yerly, D., et al. Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance. J Virol. 82, 3147-3153 (2008).

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इम्यूनोलॉजी अंक 88 तकनीक खोजी है टी सेल प्रतिक्रिया फ्लो Multiparameter सीटीएल परख Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) CellTrace वायलेट (केबल टीवी) सेल प्रसार डाई eFluor 670 (सीपीडी)
टी सेल प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के लिए फ्लोरोसेंट लक्ष्य सारणियों का प्रयोग करें<em&gt; में विवो</em
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Quah, B. J. C., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo. J. Vis. Exp. (88), e51627, doi:10.3791/51627 (2014).

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