A طريقة Permeabilization من<em> ذبابة الفاكهة</em> الأجنة للفحوصات الصغيرة جزيء آخر
Summary
إدخال جزيئات صغيرة إلى تطوير ذبابة الفاكهة الجنين تقدم إمكانية كبيرة للتميز النشاط البيولوجي لمركبات جديدة، والمخدرات، والسموم، وكذلك لبحث مسارات التنموية الأساسية. الطرق الموضحة في هذه الوثيقة الخطوط العريضة الخطوات التي تغلب على الحواجز الطبيعية لهذا النهج، وتوسيع المنفعة من طراز الجنين ذبابة الفاكهة.
Abstract
كان الجنين ذبابة الفاكهة طويلة نموذجا مختبر قوية لتوضيح الآليات الجزيئية والجينية التي تتحكم في التنمية. سهولة التلاعب الجيني مع هذا النموذج قد حل محل النهج الدوائية التي هي شائعة في النماذج الحيوانية الأخرى والمقايسات خلية مقرها. نحن هنا تصف التطورات الحديثة في البروتوكول الذي يتيح تطبيق الجزيئات الصغيرة إلى تطوير ذبابة الفاكهة الجنين. تفاصيل طريقة الخطوات للتغلب على الكتامة من قشر البيض مع الحفاظ على سلامة الجنين. ويتحقق قشر البيض permeabilization عبر مجموعة واسعة من مراحل النمو عن طريق تطبيق الموصوفة سابقا د الليمونين الجنين permeabilization المذيبات (EPS 1) والشيخوخة الأجنة في انخفاض درجة الحرارة (18 درجة مئوية) قبل العلاج. بالإضافة إلى ذلك، يتم وصف استخدام صبغة حمراء بعيدة (CY5) كمؤشر permeabilization، وهو متوافق مع تطبيقات المصب التي تشمل انفلونزا الحمراء والخضراء القياسيةالأصباغ orescent في الأعمال التحضيرية الحية والثابتة. هذا البروتوكول تنطبق على الدراسات التي تستخدم المركبات النشطة بيولوجيا لبحث آليات التنموية فضلا عن الدراسات التي تهدف إلى تقييم النشاط ماسخة أو دوائية من جزيئات صغيرة uncharacterized.
Introduction
يستمر الجنين ذبابة الفاكهة ليكون نموذجا رئيس الوزراء للتحقيق في الآليات الأساسية للتنمية 2. يتم اعتماد هذا النموذج قوية من قبل مجموعة واسعة من الأدوات الجينية الجزيئية التي تسمح التلاعب من الأساس أي الجينات في أي نقطة زمنية وضمن أي جهاز النامية. حجم صغير، والتطور السريع، وتوصيف واسعة من التشكل الجنين ذبابة الفاكهة جعله نموذجا للاختيار للشاشات الوراثية، وكثير منها قد كشفت مسارات التنموية الأساسية 3،4. وقد اتسمت العديد من الظواهر في الجنين ذبابة الفاكهة والتأويل هي بسهولة، وغالبا ما توفر وسيلة لتحديد الآليات الوراثية الجزيئية الكامنة وراء مسؤولة عن سمة غير طبيعية.
تاريخيا، كان أحد أوجه القصور في نموذج جنين ذبابة صعوبة إدخال جزيئات صغيرة إلى الأنسجة الجنينية. لقد طرحت هذه العقبة القيود على: 1) لناجي النشطة بيولوجيا الجزيئات الصغيرة المعروفة باسم تحقيقات لاستجواب الآليات التنموية و2) باستخدام هذا النموذج الذي أنشئ لتقييم النشاط ماسخة أو دوائية من جزيئات صغيرة uncharacterized. نتيجة لذلك، لم تستغل استغلالا كافيا إمكانية فحص الجنين ذبابة في توصيف النشاط جزيء صغير.
تسليم الجزيئات الصغيرة إلى الجنين ذبابة يمكن أن يتحقق مع طريقتين: 1) permeabilization من قشر البيض و2) حقن مكروي. تقدم هذه المقالة التقدم لطريقة permeabilization التي هي سهلة لتنفيذ في إعداد مختبر ذبابة الفاكهة التقليدية. تجدر الإشارة إلى أن التطورات الحديثة في طرق حقن مكروي مع التكنولوجيا على microfluidics تساهم أيضا إلى أساليب إدخال المركبات إلى 5،6 الجنين. إدخال جزيئات إلى الجنين والوقاية منها عن طريق طبقة شمعية من قشر البيض 7. يتكون قشر البيض ذبابة الفاكهة من خمس طبقات. منالداخل الى الخارج وهم: الغشاء المحي، وطبقة شمعية، وطبقة المشيمية الداخلية، وباطنة المشيماء ومشيماء أديمية ظاهرة 8. يمكن إزالة طبقات المشيمي الخارجي الثلاثة الطلوع وجيزة من الجنين في تمييع التبييض، ويشار إليها باسم خطوة dechorionation. ويمكن بعد ذلك للخطر طبقة شمعية كشفها بواسطة التعرض للمذيبات العضوية، مثل هيبتان واوكتان 7،9، مما يجعل الجنين dechorionated قابلة للاختراق، في حين لا يزال المغطى في الغشاء المحي الأساسية. ومع ذلك، واستخدام هذه المذيبات يدخل المضاعفات الناجمة عن سميتها وصعوبة في تنظيم عملها permeabilizing قوية، وكلاهما له آثار سلبية على سلامة الجنين صارخ 9،10.
وثمة طريقة permeabilization باستخدام تكوين الجنين يطلق permeabilization المذيبات (EPS) التي سبق وصفها 1. يتكون هذا المذيب من د الليمونين والمشتقة من النباتات، التي تمكن السطحي المذيب لتكون misciblالبريد مع مخازن مائي. سمية منخفضة من د الليمونين والقدرة على تمييع المذيبات لتركيزات المطلوب قد حقق وسيلة فعالة لتوليد أجنة قابلة للاختراق مع قابلية عالية 1. ومع ذلك، فقد استمرت اثنين من العوامل الذاتية لتحقيق القيود على التطبيق. الأولى، إثبات عدم التجانس الأجنة في نفاذية بعد العلاج EPS، حتى عندما يتم الحرص على الحفاظ على التدريج التنموية وثيق. الثانية والأجنة أثبتت مضى عليها أكثر من ثماني ساعات تقريبا الصعب permeabilize، بما يتفق مع تصلب قشر البيض الذي يحدث بعد وضع البيض 11.
الموصوفة هنا هي التقدم في طريقة EPS ما يلي: 1) المساعدة في تحديد وتحليل الأجنة permeabilized شبه مماثل، حتى بعد تنفيذ الخطوات التثبيت والمناعية و2) تمكين permeabilization الأجنة في وقت متأخر من النقاط الزمنية التنموية (> 8 ساعة، المرحلة 12 وما فوق). على وجه التحديد، وتطبيق صبغة الحمراء بعيدة،حمض الكربوكسيلية CY5، يوصف يخدم كمؤشر النفاذية، والتي استمرت في الجنين خلال تطوير والفورمالديهايد بعد التثبيت. بالإضافة إلى ذلك، وتبين أن تربية الأجنة عند 18 درجة مئوية يحافظ على قشر البيض في حالة حساسة EPS، وتمكين permeabilization الأجنة في المراحل المتأخرة (12-16 المراحل).
هذه التطورات التغلب على القيود التي سبق ذكرها للمنهجية EPS. وبالتالي فإن هذا التطبيق توفير المحققين مع وسيلة لإدخال جزيئات صغيرة من الفائدة إلى الجنين في نقاط متميزة الوقت التنموية مع الحفاظ على قدرتها على البقاء.
Protocol
Representative Results
Discussion
يحدد الأسلوب أعلاه وسيلة الحصول على أجنة قابلة للحياة ذبابة الفاكهة التي هي في متناول العلاجات جزيء صغير عبر مجموعة واسعة التنموية. هذا الأسلوب يقدم الرواية والاستنتاج بسيط هو أن الشيخوخة الأجنة عند 18 درجة مئوية تمكن permeabilization الأجنة مرحلة متأخرة مع نفس فعالية ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).
Materials
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
Referências
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).
- Jaeger, J., Manu, J., Reinitz, Drosophila blastoderm patterning. Curr Opin Genet Dev. 22, 533-541 (2012).
- Kopczynski, C. C., et al. A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).
- Bejsovec, A., Chao, A. T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation. Development. 139, 690-698 (2012).
- Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens. Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).
- Delubac, D., et al. Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection. Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).
- Mahowald, A. P. Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos. Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).
- Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes. Cryobiology. 29, 210-239 (1992).
- Arking, R., Parente, A. Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique. The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).
- Li, J. S., Li, J. Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).
- Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos. Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).
- Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos. Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, 518 (1994).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. Methods in Cell Biology. 44, 445-487 (1994).
- Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster. Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).
- Limbourg, B., Zalokar, M. Permeabilization of Drosophila eggs. Developmental biology. 35, 382-387 (1973).
- Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos. Fly (Austin). 7, (2013).
