의 Permeabilization의 방법<em> 초파리</em작은 분자 활동의 분석 실험을위한> 태아
Summary
개발 Drosophila의 배아에 작은 분자의 도입은 신규 화합물, 약물 및 독성 물질의 생물학적 활성의 특성뿐만 아니라 기본적인 발달 경로를 프로빙을위한 큰 잠재력을 제공합니다. 설명하는 방법은 여기에 초파리 배아 모델의 유틸리티를 확대,이 방법 자연 장벽을 극복 단계를 설명합니다.
Abstract
Drosophila의 배아는 긴 개발을 제어하는 분자 유전 메커니즘을 해명하기위한 강력한 실험실 모형이다. 이 모델의 유전 조작의 용이성은 다른 동물 모델 및 세포 기반 분석에서 평범 약물 접근 방식을 대신하게했다. 여기에 우리가 개발 초파리 배아에 작은 분자의 응용 프로그램을 사용할 수있는 프로토콜의 최근의 진보에 대해 설명합니다. 이 방법은 태아의 생존 능력을 유지하면서 껍질의 불 투과성을 극복하는 단계를 자세히 설명합니다. 발달 단계의 넓은 범위에 걸쳐 달걀 껍질 permeabilization 용매 이전에 설명 D-리모넨 배아 permeabilization (1 EPS)의 응용 프로그램과 (18 ° C) 이전 치료에 감소 된 온도에서 노화의 배아에 의해 달성된다. 또한, permeabilization 표시로 원적외선 염료 (CY5)의 사용은 표준 빨간색과 녹색 독감을 포함한 다운 스트림 응용 프로그램과 호환되는, 설명라이브 및 고정 준비에 orescent 염료. 이 프로토콜은 발달 메커니즘을 조사뿐만 아니라 특성화되지 않은 작은 분자의 기형 또는 약리학 적 활성을 평가하기위한 연구에하는 생리 활성 화합물을 사용하여 연구에 적용 할 수있다.
Introduction
Drosophila의 배아 개발 2의 근본적인 메커니즘의 조사를 위해 최고의 모델이되고 있습니다. 이 강력한 모델은 임의의 시점에서 그리고 어떠한 현상 기관 내에 실질적으로 어떤 유전자의 조작을 허용하는 분자 유전 학적 도구의 다양한 배열에 의해지지된다. 초파리 배아의 형태 형성의 작은 크기, 빠른 개발, 다양한 특성은 기본적인 발달 경로에게 3,4를 발견했습니다 많은 것이 유전 스크린에 대한 선택의 모델을 확인합니다. Drosophila의 배아에 많은 표현형이 특징으로 쉽게 해석 할 수 있으며, 종종 비정상적인 특성에 대한 책임을 기본 분자 유전 학적 메커니즘을 식별 할 수있는 수단을 제공하고있다.
역사적으로, 플라이 배아 모델의 단점은 배아 조직에 작은 분자를 도입하는 어려움이있다. 1) 우리 :이 장애물에 대한 제한을 제기했다프로브가 발달 메커니즘을 심문하고 2) 특성화되지 않은 작은 분자의 기형 또는 약리학 적 활성을 평가하는이 설립 모델을 사용하기로 알려진 생리 활성 작은 분자를 주입. 결과적으로, 비행 배아의 스크리닝 전위 저분자 활성의 특성화에 미달되었다.
달걀 껍질의 1) permeabilization 2) 미세 주입 : 플라이 배아에 작은 분자의 배달은 두 가지 방법으로 달성 될 수있다. 이 문서에서는 기존의 초파리 실험의 설정에서 실행하기 쉬운 permeabilization 방법에 대한 발전을 제시한다. 이는 마이크로 유체 기술 마이크로 인젝션 방식에서 최근의 진보는 또한 배아 5,6 화합물에 도입하는 방법에 기여하는 것을 주목해야한다. 배아에 분자를 소개하는 껍질 (7)의 밀랍 층에 의해 방지 할 수있다. 초파리의 알 껍질은 5 개의 층으로 구성되어 있습니다. 부터인사이드 아웃 그들은 : 난황 막, 밀랍 층, 내부 융모막 층, endochorion 및 exochorion 8. 세 가지 외부 융모 층은 희석 표백제에있는 태아의 간단한 출현에 의해 제거 될 수있다, 단계 dechorionation라고도합니다. 그것은 내부 난황 막 쌌다 유지하면서 노출 된 왁시 층은, dechorionated 배아 투과성 렌더링 헵탄 및 옥탄 7,9 같은 유기 용매에의 노출에 의해 손상 될 수있다. 그러나 이러한 용매의 사용은 독성과 태아의 생존 능력 9,10에 뚜렷한 부정적인 영향이 둘 다 자신의 강한 permeabilizing 조치를, 조절에 어려움으로 인한 합병증을 소개합니다.
용매 조성물 칭했다 배아 permeabilization (EPS)를 사용 permeabilization의 방법은 이전에 1을 설명 하였다. 이 용매 miscibl되는 용매를 사용 D-리모넨 및 식물 유래의 계면 활성제로 구성수성 버퍼와 전자. D-리모넨 원하는 농도로 용매를 희석 할 수있는 능력의 낮은 독성이 높은 생존력으로 투과 한 배아를 생성하는 효과적인 방법을 수득했다. 그러나,이 내인성 인자는 애플리케이션에 제한을 가지고 계속했다. 첫째, 배아 관리가 가까운 개발 준비를 유지하기 위해 취해야하는 경우에도, EPS 처리 후 투과성의 이질성을 보여줍니다. 둘째, 약 8 시간보다 오래된 계란 11 누워 후 발생하는 껍질의 경화와 일치, 투과하기 어려운 입증 된 배아.
여기에 설명 된 EPS 방법의 발전은 그 : 1) 고정 및 면역 염색 단계를 실행하고 2)> (늦은 발달 시점에서 8 시간, 단계 배아의 permeabilization을 활성화 한 후에도 거의 동일 permeabilized 배아를 식별하고 분석하는 데 도움이 12 세 이상). 특히, 원적외선 염료의 응용 프로그램,CY5 카르 복실 산을, 개발하는 동안 포름 알데히드 고정 후 배아에서 계속 투과성 표시기 역할이 설명되어 있습니다. 또한, 18 ° C에서 배아를 양육하는 최종 단계의 배아 (단계 12 ~ 16)의 permeabilization을 가능하게 EPS 민감한 상태에서 껍질을 유지 것을 알 수있다.
이러한 진보는 EPS 방법론에 앞서 언급 한 한계를 극복. 이 응용 프로그램은 따라서 생존 능력을 유지하면서 별개의 발달 시점에서 배아의 관심 작은 분자를 소개 할 수있는 방법으로 조사를 제공 할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
위의 방법은 다양한 개발 범위에 걸쳐 작은 분자 치료에 접근 가능한 Drosophila의 배아를 획득 할 수있는 방법을 설명합니다. 이 방법은 이전에는 초기 단계의 배아에서와 같이 18 ° C에서 배아를 노화 동일한 효능과 최종 단계의 배아의 permeabilization을 가능하게하는 소설과 간단한 발견을 소개합니다. 또, 투과 표시와 같은 원적외선 염료 CY5 카르 복실 산의 사용은 포스트 픽스 애플리케이션?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).
Materials
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
Referências
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