組換えセルラーゼCEL5Aの式から<em>トリコデルマ·</em>タバコ植物における
Summary
タバコ植物を、一過性発現系を介して、真菌セルラーゼ、TrCel5Aを作製した。発現は、蛍光融合タンパク質を用いてモニターすることができ、タンパク質活性を発現後に特徴付けた。
Abstract
セルロース分解酵素、セルラーゼは、研究と産業の利益の両方の標的である。このような菌糸構築真菌および嫌気性細菌などの難培養する生物におけるこれらの酵素の優勢は、この分野における組換え技術の使用を早めました。植物発現法は、酵素および他の工業的に有用なタンパク質の大規模生産のための望ましいシステムである。ここで、 ニコチアナ·タバカムにおける真菌エンドグルカナーゼ、 トリコデルマ·CEL5Aの一過性発現のための方法は、実証される。成功したタンパク質発現はmCherry-酵素融合タンパク質を用いて蛍光によってモニターし、示されている。さらに、基本的な一連のテストは、一過性に発現T.の活性を調べるために使用されているSDS-PAGE、ウェスタンブロッティング、ザイモだけでなく、蛍光染料ベースの基質分解アッセイを含むデルマレー CEL5A、。ここで説明するシステムは、アクティブセルを製造するために使用することができる短時間でulase、構成的または誘導性発現系を介して植物におけるさらなる生産の可能性を評価するようになっている。
Introduction
リグノセルロース系バイオマスを液体燃料への変換の劣化が化石燃料への依存を低減する方法として想定されている。経済的に実現可能なバイオマス処理システムを確立する上での一つの重要なハードルは、セルロースとヘミセルロース1の酵素分解である。植物発現系は、工業的規模での酵素の産生のための大きな可能性を示している。彼らは何千年もの間あったように収穫植物経済的にもボリューム内の農業システムは、すでに確立されています。植物におけるセルラーゼの生産は、2自己加水分解の容易さ、および植物細胞壁1の消化率を増加させることによって、より低い酵素レベルの使用を最大にするための電位のような要因に望ましい。最後に、植物系は、植物細胞の特定の領域への組換えタンパク質の標的化を可能にし、翻訳後3を必要な酵素を変更することができる。
"ve_content>ニコチアナ·タバコ （タバコ）は非常に一般的に、その急速な成長とバイオマス蓄積機能4に、植物における異種タンパク質発現の研究のためのモデル生物として使用されます。組換えタンパク質の一過性発現が局在化および選択されたタンパク質の翻訳後修飾、したがって、 即ちセルラーゼのような柔軟性を維持しつつ、短時間5におけるタンパク質産生を可能にする技術である。また、植物における発現のさらなる戦略のための基礎を敷設しながら、基本的な分析のためのセルラーゼ（単数または複数）の産生を可能にする。このような一過性発現戦略を用いて、真菌宿主トリコデルマ·リーゼイ （ ハイポクレアジェコリーナ ）由来のグリコシルヒドロラーゼファミリー5、CEL5A、6からエンドグルカナーゼ（以下TrCel5Aと呼ぶ）が生成される。 TrCel5Aはネイティブにグリコシル化されている42 kDaのタンパク質であり、HYDに高活性であるセルロース鎖7を roylzing。
ここで説明する一過性発現技術は、植物はアグロバクテリウムは 、適切な発現ベクターに目的の遺伝子を保有する葉浸潤、比較的一般的に使用されるシステムに基づいている。 インプランタ発現の成功の迅速な分析を可能にするために、TrCel5AもmCherry、本来ディスコソマ（Discosoma）種に由来する単量体の蛍光タンパク質との融合タンパク質として発現させることができる。タンパク質DsRedは8、さらに6ヒスチジン残基（Hisタグ）は、に融合してC末端（TrCel5A-mCherry）。異種融合タンパク質、TrCel5A-mCherryの発現は、このようにmCherryの分散を調べるために緑色光を用いて成長した植物内で監視することができる。所望であれば、植物材料の薄い部分は、タンパク質の特異的な局在を確立するために顕微鏡的に緑色光下で検査することができる。この作品、信号TRANのため座るペプチドは、小胞体から9異種タンパク質輸送をローカライズするために、構築物に組み込まれた。
TrCel5Aを含む植物発現セルラーゼの活性を分析するために、セルラーゼ活性試験の数を実行することができる。全可溶性植物タンパク質を抽出した後、TrCel5Aは、部分的に熱インキュベーション法を用いて精製することができる。タンパク質サイズは、ウェスタンブロッティング、続いてSDS-PAGEを使用して確立される。溶解度10：ザイモグラフィーはカルボキシメチル化（CMCカルボキシメチルセルロースの製造）されたセルロース、例えば 、基質に対する活性を分析するために使用することができる。セルラーゼとグルコシダーゼ活性は、（4-MUC合わせた）β-D-セロビオシドに関連付けられたフルオロフォア4 – メチルウンベリフェリル（4-MU）を使用してモニターすることができる。エンドグルカナーゼ活性を評価するための別の方法は、アゾdで関連付けられているCMCの分析を含むあなたがた（RemazolbrilliantブルーR）11。また、エンドグルカナーゼ及びセルラーゼの範囲の両方のタンパク質の活性は、p-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（PAHBAH）アッセイ12などの糖分析試験の使用によりモニターすることができる。これらの技術は、目的の発現セルラーゼの活性を解明し、定量することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
セルラーゼの組換え発現は、より効率的なバイオ燃料生産システム1のための欲求に、大きな関心の分野である。植物は、このような経済的な収穫技術や、大規模なバイオ燃料生産のための非常に望ましい特性であること自己加水分解法などの機能により、成功したセルラーゼの生産のための多くの可能性を提供します。また、タンパク質を産生するための別のローカリゼーションを?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、BMBF Forschungsinitiativeによってサポートされていました」BioEnergie 2021 – Forschung毛皮はNutzungフォンBiomasseダイ」と科学を推進するため、ドイツ連邦政府と州政府によってエクセレンス·イニシアチブを通じて資金を供給されている優秀「バイオマスからのオーダーメイド燃料」、のクラスターをとドイツの大学での研究。
Materials
| 4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside | SIGMA-ALDRICH | M6018 | |
| Acetic acid | ROTH | 3738 | |
| Acetosyringon (concentrated) | ROTH | 6003 | |
| Antibiotic – kanamycin | ROTH | T832 | |
| Antibiotic – rifampicin | ROTH | 4163 | |
| Antibiotic – carbenicillin | ROTH | 6344 | |
| Antibody – rabbit anti His(6) pAb | ROCKLAND | 600-401-382 | |
| Antibody – goat anti rabbit AP, FC pAb | DIANOVA | 111-055-008 | |
| Azo-carboxymethyl cellulose | MEGAZYME | S-ACMC | |
| β-cyclodextrin | SIGMA-ALDRICH | C4805 | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA-ALDRICH | C5080 | |
| Carboxymethyl cellulose | ROTH | 3333.1 | |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | SIGMA-ALDRICH | C2730 | |
| Congo red | SIGMA-ALDRICH | 75768 | |
| Coomasie brilliant blue G 250 | ROTH | 9598.2 | |
| D(+)-glucose | ROTH | 8337 | |
| Ethanol | ROTH | K928 | |
| Filter paper – Rotilabo blotting paper | ROTH | CL67 | |
| NBT/BCIP | SIGMA-ALDRICH | 72091 | |
| MES buffer | ROTH | 4256 | |
| Methanol | ROTH | 8388 | |
| Sodium citrate | ROTH | 3580 | |
| Sodium dodecylsulfate | SERVA | 20765 | |
| Sodium hydroxide | ROTH | 6771 | |
| Soil, Einheitserde classic | PATZER GMBH | ||
| Spectrometer – Infinite M200 | TECAN | ||
| Sucrose | SIGMA-ALDRICH | S-5390 | |
| 4-Hydroxy benzhydrazide | SIGMA-ALDRICH | H9882 | |
| Phosphate buffered saline | ROTH | 1058 | |
| UV light source – BLAK RAY | UVP | ||
| Vibratome – VT1000S | Leica |
Referências
- Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
- Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development. Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).
- Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion. Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).
- Sharma, A. K., Sharma, M. K. Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities. Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).
- Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins. Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).
- Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A. Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).
- Saloheimo, M., et al. EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme. Gene. 63, 11-21 (1988).
- Davidson, M. W., Campbell, R. E. Engineered fluorescent proteins: innovations and applications. Nature Methods. 6, 713-717 (2009).
- Pelham, H. R. The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum. Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).
- Béguin, P. Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas. Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).
- Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides. Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).
- Lever, M. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).
- Maclean, J., et al. Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).
- Munro, S., Pelham, H. R. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell. 48, 899-907 (1987).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Burnette, W. N. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets – procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).
- Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).
- Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).
- Sammond, D. W., et al. Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation. PLoS One. 7, (2012).
- Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O’Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica. Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).
