Eine Immunfluoreszenz-Verfahren zur Charakterisierung von Barrett-Ösophagus Cells
Summary
Es gibt einen erkennbaren Bedarf für verbesserte Informationen über molekulare Fahrer von Barrett-Ösophagus. Immunfluoreszenzfärbung ist eine nützliche Technik für das Verständnis der Wirkung von Zell-Signalisierung auf Zellmorphologie. Wir stellen eine einfache, effektive Protokoll für die Verwendung des Immunfluoreszenzfärbung auf therapeutische Behandlung im Barrett-Ösophagus-Zellen zu beurteilen.
Abstract
Adenokarzinom des Ösophagus (EAC) hat eine Gesamtüberlebensrate von weniger als 17% und die Häufigkeit von EAC hat sich in den vergangenen zwei Jahrzehnten gestiegen. Einer der primären Risikofaktoren EAC Barrett-Ösophagus (BE), ein metaplastischen Veränderungen der normalen Plattenepithel Speiseröhre in Reaktion auf chronische Sodbrennen. Trotz der etablierten Verbindung zwischen EAC und BE, Abfrage der molekularen Ereignisse, insbesondere veränderte Signalwege unter Beteiligung Progression sein, EAC, werden kaum verstanden. Vieles davon ist aufgrund des Fehlens von geeigneten in vitro-Modelle zur Verfügung, um diese Krankheiten zu untersuchen. Kürzlich immortalisierenden Zelllinien sind im Handel erhältlich so dass für in vitro Untersuchungen von BE. Hier stellen wir ein Verfahren zur Immunfluoreszenzfärbung von immortalisierenden Zelllinien, so dass in-vitro-Charakterisierung von Zellsignalen und der Struktur nach der Belichtung, um therapeutische Verbindungen. Anwendung dieser Techniken wird help entwickeln Einblick in die Mechanismen sein, um EAC Progression beteiligt und bieten potenziellen Möglichkeiten für Behandlung und Vorbeugung von EAC.
Introduction
Barrett-Ösophagus (BE) ist eine metaplastischen Veränderung der normalen Plattenepithel der Speiseröhre und Folge einer chronischen Exposition gegenüber den Mageninhalt von gastroösophagealen Reflux-Krankheit (GERD) 1 resultieren. BE wird gedacht, um ein Schutzmechanismus in Reaktion auf GERD sein, aber die Anwesenheit von BE verleiht ein erhöhtes Risiko für Speiseröhrenkrebs Adenokarzinom (EAC), eine Krankheit, die eine deutlich schlechte Überlebens 1 trägt. Aktuelle Schätzungen gehen davon aus, dass bis zu 5,6% der amerikanischen Bevölkerung haben sich jedoch als BE ist oft asymptomatisch, es wird vermutet, dass die Mehrheit der BE bleibt unerkannt 2. Als Inzidenzraten sowohl GERD und EAC haben weitere Wachstum 3 zu sehen, ist es wichtig geworden, um die molekularen Mechanismen in der Progression von BE zu EAC Beteiligten verstehen, insbesondere da diese Informationen könnte möglicherweise therapeutische Ansätze zur Verhinderung der Progression werden, um EAC.
<p class="jove_content"> Patienten gerichtet Studien haben in der aktuellen Paradigma der BE-EAC Pathogenese 1 geführt. Chronische Entzündungen, Verletzungen und gentoxische Schäden durch längere Einwirkung von Mageninhalt ausüben resultierende Selektionsdruck auf der BE-Läsion Förderung neoplastischen Progression zu EAC. Eine Reihe von genetischen Veränderungen identifiziert wurden während EAC Progression BE. Doch trotz dieser gibt es einen deutlichen Mangel an Verständnis über die genauen Änderungen in der Zellsignalisierung und Folgewirkungen auf Zellstruktur und Funktion.In vitro Zellinien immortalisiert sind nützliche Werkzeuge für die Untersuchung der Wirkungen von Zellsignalen, insbesondere bei der Untersuchung der Auswirkungen der gezielten therapeutischen Verbindungen. Die jüngste kommerzielle Verfügbarkeit von verewigt Zelllinien erlaubt für solche Studien. Obwohl Hochdurchsatz-Assays, wie etwa die weit verbreitete Lebensfähigkeitstests, kann wertvoll in der Beurteilung der Auswirkungen von gezielten Therapien bei der Zellproliferation und-su seinrvival 4-6, sind diese Tests nicht sinnvoll, für die Abfrage der Auswirkungen der Zellsignalisierung auf Zellmorphologie. Immunfluoreszenzfärbung (IF) ist eine nützliche Technik für die Untersuchung der Wirkungen von zielgerichteten Therapien auf den morphologischen, Wachstum und Überleben von Zellen und Eigenschaften der Proteine, die beteiligt sind. Unser Labor hat diese Methoden zu verewigen Zelllinien angepasst, mit IF, um die Auswirkungen einer klinisch verfügbare Medikament auf BE-Zelllinien in der Hoffnung auf eine mögliche Abgrenzung chemopreventative Behandlung und Biomarker für die medikamentöse Behandlung 7 zu beurteilen. Ähnlich Anwendung dieser Techniken in EAC, BE und verewigt Speiseröhre Zelllinien hat kritische Feststellungen zu werden, um EAC Progression 8-10 abgegrenzt. Wir finden, ZF-Analyse von BE-Zellen mit gezielten Therapien behandelt hat einen Wert, so dass für die Charakterisierung von Veränderungen in der Zellstruktur und Proteinlokalisierung. Hier präsentieren wir unsere Methoden für ZF von verewigt Zellen characterize medikamentöse Behandlung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben ein Verfahren für die Anwendung der IF von BE-Zellen in Richtung der Aufklärung der physiologischen Wirkungen von zielgerichteten Therapien bei diesen Zellen beschrieben. Zwar haben wir die Verwendung dieser Verfahren zur BE-Zellen beschrieben, haben wir gefunden, daß diese Verfahren auch auf eine Vielzahl von verschiedenen Zelltypen 13,17,18. Ferner können diese Verfahren auf verschiedene Weise zu Färbung für bestimmte Ziele zu optimieren verändert werden.
Wir fi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem St, Joseph-Stiftung (AJF, LJI) und American Lung Association, RG-224607-N (LJI) unterstützt.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description (optional) |
| CP-A (Metaplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4027 | |
| CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4028 | |
| CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4029 | |
| CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4030 | |
| Keratinocyte-SFM (1X), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25200056 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, HI | Life Technologies | 10438026 | |
| PSN ANTIBIOTIC MIXTURE | Life Technologies | 15640 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Circular Glass Coverslip 18mm | Fisher Scientific | 15-183-86 | |
| β-catenin Primary Antibody (Rabbit) | Cell Signaling | 9562S | |
| Alexafluor 488 (Goat Anti-Rabbit) | Life Technologies | A11008 | |
| 10cm TC treated PS dish, sterile | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| 12-well TC treated PS plate, sterile | USA Scientific | 5666-5180 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Bovine Serum Albumin – Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| SKI-606 (Bosutinib) | Selleck Chemicals | S1014 | |
| Square Bioassay Dish | Thermo Scientific | 240835 | |
| Parafilm | VWR | 82024-546 | |
| Disposable Pasteur Pipets, Flint Glass | VWR | 14672-380 | |
| Nexcelom Mini Cell Counter | Nexcelom | ||
| Cellometer Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-014 | |
| Zeiss Apotome microscope | Zeiss |
Referências
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