바렛 식도 세포의 특성에 대한 면역 방법
Summary
바렛 식도의 분자 드라이버에 대한 개선 된 정보를 식별 할 필요가있다. 면역 형광 염색은 세포 형태에 세포 신호 전달의 효과를 이해하기위한 유용한 기술이다. 우리는 바렛 식도 세포의 치료 적 처치를 평가하기 위하여 면역 형광 염색법을 사용하기위한 간단한 효과적인 프로토콜을 제시한다.
Abstract
식도 선암 (EAC)는 전체 생존보다 17 %의 속도와 EAC의 발병률은 지난 20 년 동안 극적으로 증가했다가 있습니다. EAC의 주요 위험 요인 중 하나는 바렛 식도 (BE), 만성 가슴 앓이에 대한 응답으로 정상 편평 식도의 화생이 있으면서 변화입니다. EAC 사이의 잘 설정된 연결에도 불구하고, 분자 이벤트의 진행을 포함 특히 변경된 신호 전달 경로의 심문은 EAC에, 제대로 이해 못할 것이다. 이 중 대부분은 이러한 질병을 연구하는 데 사용할 수 체외 모델에 적합한의 부족 때문이다. 최근 불후의 BE 세포주 BE의 생체 연구를 허용 시판되고있다. 여기서, 우리는 치료 화합물에 노출 된 후 세포 신호 및 구조의 시험 관내 특성화 있도록 BE 불멸화 세포주의 면역 염색을위한 방법을 제시한다. 이러한 기술의 적용은 그러는 것p는 EAC 진행하는에 관련된 메커니즘에 대한 통찰력을 개발하고 치료 및 EAC의 예방을위한 잠재적 인 수단을 제공합니다.
Introduction
바렛 식도 (BE)은 식도의 편평 상피 세포 및 정상적인 위 식도 역류 질환 (GERD) (1)로부터 얻어진 위 내용물에 대한 만성 노출의 결과에 화생이 있으면서 변화이다. BE는 GERD에 대한 응답으로 보호 메커니즘 것으로 생각됩니다, 그러나 BE의 존재는 식도 선암 (EAC), 현저하게 생존율 1을 전달하는 질병의 증가 위험을 부여. 현재 견적은 미국 인구의 최대 5.6 %가달라고하는 것이 좋습니다 BE는 종종 무증상으로, 그러나, BE의 대부분이이 진단되지 않은 남아 있다고 생각합니다. GERD와 EAC 모두의 발생률이 계속 성장 3 본 바와 같이,이 정보는 잠재적으로 EAC하는의 진행을 방지하는 방향으로 치료 방법을 제공 할 수있다, 특히로, EAC하는의 진행에 관여하는 분자 메커니즘을 이해하는 것이 중요 해지고있다.
<p class="jove_content"> 환자 관한 연구는 BE-EAC 병인 1의 현재 패러다임에 성공. 만성 염증, 상처, 그리고 위의 내용에 장기간 노출로 인한 유전 독성 피해는 EAC에 종양의 진행을 촉진 BE 병변에 선택적 압력을 발휘. 유전 변경의 숫자는 동안 EAC 진행하는 확인되었습니다. 그러나 이것에도 불구하고 세포 신호의 정확한 변화와 세포의 구조와 기능에 따라 이후의 영향에 대한 이해의 명백한 부족하다.특히 표적 치료 화합물의 효과를 조사에서, 세포 신호 전달의 효과를 연구하기위한 유용한 도구가 시험 관내 세포 라인에 불멸화. 불후의 BE 세포주의 최근 상용화는 연구 할 수 있습니다. 이러한 널리 사용 생존력 분석 높은 처리량 분석법은 세포 증식 및 스와시 타겟 요법의 효과를 평가하는데 유용 할 수 있지만rvival 4-6, 이러한 분석은 세포 형태에 따라 세포 신호 전달의 효과를 심문하는 데 유용하지 않습니다. 면역 형광 염색 (IF)는 세포의 형태학, 성장 및 생존 성과 관련된 단백질시 타겟 요법의 효과를 조사하기위한 유용한 기술이다. 우리 연구소는 약물 치료 7 가능한 화학적 예방법 처리 및 바이오 마커를 서술의 희망 BE 세포 라인에 따라 임상 적으로 사용 가능한 약물의 효과를 평가하는 경우에 사용하는, 불후의 BE 세포 라인으로 이러한 방법을 적용하고있다. 마찬가지로, EAC에서 이러한 기술의 응용 프로그램이 있고 그리고 불후의 식도 세포 라인은 EAC 진행 8-10 일 수에 관한 중요한 연구 결과를 서술하고있다. 표적으로 한 치료로 치료 세포의 분석은 세포 구조와 단백질 지방화의 변화 특성을 허용, 가치가 있다면, 우리는 찾을 수 있습니다. 여기, 우리는 우리의 방법을 제시 IF C로되어 영원 세포의약물 치료를 haracterize.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는이 세포에 따라 타겟 요법의 생리적 효과를 해명으로 BE 세포의 IF를 적용하는 방법을 설명했다. 우리는 BE 세포 향한 이러한 절차의 사용을 설명하는 동안, 우리는이 방법 또한 다른 세포 유형 13,17,18의 다양한 적용 할 수있는 것으로 나타났습니다. 또한, 이러한 절차는 특정 대상에 대한 염색을 최적화하는 여러 가지 방법으로 변경할 수 있습니다.
우리는 적절?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 세인트 조셉 재단 (AJF, LJI)과 미국 폐 협회, RG-224607-N (LJI)에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description (optional) |
| CP-A (Metaplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4027 | |
| CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4028 | |
| CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4029 | |
| CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4030 | |
| Keratinocyte-SFM (1X), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25200056 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, HI | Life Technologies | 10438026 | |
| PSN ANTIBIOTIC MIXTURE | Life Technologies | 15640 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Circular Glass Coverslip 18mm | Fisher Scientific | 15-183-86 | |
| β-catenin Primary Antibody (Rabbit) | Cell Signaling | 9562S | |
| Alexafluor 488 (Goat Anti-Rabbit) | Life Technologies | A11008 | |
| 10cm TC treated PS dish, sterile | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| 12-well TC treated PS plate, sterile | USA Scientific | 5666-5180 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Bovine Serum Albumin – Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| SKI-606 (Bosutinib) | Selleck Chemicals | S1014 | |
| Square Bioassay Dish | Thermo Scientific | 240835 | |
| Parafilm | VWR | 82024-546 | |
| Disposable Pasteur Pipets, Flint Glass | VWR | 14672-380 | |
| Nexcelom Mini Cell Counter | Nexcelom | ||
| Cellometer Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-014 | |
| Zeiss Apotome microscope | Zeiss |
Referências
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