Há uma necessidade visível de uma melhor informação sobre os condutores moleculares de Esôfago de Barrett. Coloração de imunofluorescência é uma técnica útil para entender os efeitos da sinalização celular na morfologia celular. Nós apresentamos um protocolo simples e eficaz para o uso de coloração de imunofluorescência para avaliar tratamento terapêutico em células esôfago de Barrett.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
O método de imunofluorescência para Caracterização de Células Esôfago de Barrett
Neste artigo
Resumo
Resumo
Adenocarcinoma de esôfago (EAC) tem uma taxa de sobrevida global de menos de 17% ea incidência de EAC aumentou dramaticamente ao longo das últimas duas décadas. Um dos principais fatores de risco de EAC é o esôfago de Barrett (BE), uma mudança metaplásico do esôfago escamoso normal em resposta a azia crônica. Apesar da ligação bem estabelecida entre EAC e BE, o interrogatório dos eventos moleculares, particularmente vias de sinalização alterados envolvendo progressão da SER para EAC, são mal compreendidos. Grande parte isto é devido à falta de modelos in vitro adequados disponíveis para estudar estas doenças. Recentemente, as linhas de células imortalizadas BE tornaram-se disponíveis comercialmente permitindo estudos in vitro de BE. Aqui, apresentamos um método para coloração de imunofluorescência de linhas de células imortalizadas BE, permitindo caracterização in vitro de sinalização e estrutura da célula após a exposição a compostos terapêuticos. Aplicação destas técnicas irá help desenvolver insights sobre os mecanismos envolvidos na BE à progressão EAC e fornecer potenciais caminhos para o tratamento e prevenção da EAC.
Introdução
Esôfago de Barrett (EB) é uma mudança metaplásico no epitélio escamoso normal do esôfago e uma consequência da exposição crônica ao conteúdo gástricas resultantes da doença do refluxo gastroesofágico (DRGE) 1. BE é pensado para ser um mecanismo de proteção em resposta a RGE, no entanto, a presença de BE confere um risco aumentado de adenocarcinoma esofágico (EAC), uma doença que acarreta uma sobrevivência significativamente pobre 1. As estimativas atuais sugerem que até 5,6% da população americana tem BE, porém, como BE é muitas vezes assintomática, pensa-se que a maioria das BE permanece sem diagnóstico 2. Como as taxas de incidência....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Linha celular Manutenção
- Humana imortalizada BE displásicas de alto grau (CP-B, CP-C, CP-D) e metaplásico (CP-A) de linhas celulares por transfecção estável da telomerase humana transcriptase (TERT) de proteína 11 reversa.
- Manter BE linhas de células de queratinócitos em meio suplementado com extracto de pituitária de bovino (BPE), factor de crescimento epidérmico (EGF), 5% de soro fetal bovino (FBS), aminoácidos não essenciais (NEAA), penicilina-estreptomicina-neomicina (PSN), e padrão condições de cultura de tecidos (37 ° C, 5% de CO 2, 98% de humidade).
2. BE celular chapeamento
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Um exemplo dos resultados obtidos com a aplicação dos procedimentos descritos está ilustrada nas Figuras 1A-D. Lamelas com PC-D e FP-C BE células foram tratadas durante 24 horas com 1 uM do inibidor de Src família, SKI-606, ou veículo (DMSO) e coradas utilizando os procedimentos descritos acima para o Adherens junção de sinalização Wnt e proteína, β -catenina. Visualização de β-catenina foi conseguida por marcação com uma IgG anti-coelho acoplado a um fluoróforo verde, enquanto que a rotulagem do núcleo.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Temos delineado um método para aplicação de IF de células ser no sentido de elucidar os efeitos fisiológicos de terapias específicas sobre estas células. Embora se tenha descrito o uso desses procedimentos contra células BE, verificou-se que estes métodos também são aplicáveis a uma variedade de diferentes tipos de células 13,17,18. Além disso, esses procedimentos podem ser modificados de várias formas para optimizar a coloração para alvos específicos.
Nós encontramos um parâmet.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por doações do St, Fundação de Joseph (AJF, LJI) e American Lung Association, RG-224607-N (LJI).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| CP-A (Linha Celular Metaplásica) | ATCC | CRL-4027 | |
| CP-B (Linha Celular Displásica de Alto Grau) | ATCC | CRL-4028 | |
| CP-C (Linha Celular Displásica de Alto Grau) | ATCC | CRL-4029 | |
| CP-D (Linha Celular Displásica de Alto Grau) | ATCC | CRL-4030 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | |
| 0,25% Tripsina-EDTA (1x), Vermelho de Fenol | Life Technologies | 25200056 | |
| Soro Fetal Bovino, Qualificado, HI | Life Technologies | 10438026 | |
| PSN mistura de antibióticos | Life Technologies | 15640 | |
| PBS - Tampão com fosfato Salino | Life Technologies | 10010049 | |
| Reagente Anti-longo de Ouro com DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Lamínula de Vidro Circular 18 mm | Anticorpo Primário Fisher Scientific | 15-183-86 | |
| β-catenina (Coelho) | Sinalização Celular | 9562S | |
| Alexa Fluor 488 (Anti-Coelho de Cabra) | Life Technologies | A11008 | |
| Prato PS tratado com TC de 10 cm, estéril | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| Placa PS tratada com TC de 12 poços, estéril | USA Scientific | 5666-5180 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Cloreto de amônio | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Saponina | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Albumina de soro bovino - Fração V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| SKI-606 (Bosutinib) | Selleck Chemicals | S1014 | |
| Prato de Bioensaio Quadrado | Thermo Scientific | 240835 | |
| Parafilm | VWR | 82024-546 | |
| Pipetas Pasteur Descartáveis, Vidro Flint | VWR | 14672-380 | |
| Nexcelom Mini Contador de Células | Nexcelom | ||
| CHT4-SD100-014 | |||
| Microscópio Zeiss Apotome | Zeiss |
Referências
- Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis. Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).
- Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
