To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.
大人のゼブラフィッシュは、損傷後に中枢神経系を再生させる驚くべき能力を持っている。細胞性応答およびゼブラフィッシュ成体の中枢神経系(CNS)の再生および修復に関与する分子メカニズムを調べるために、我々は成体終脳損傷のゼブラフィッシュモデルを開発した。
このアプローチでは、手動でゼブラフィッシュ成体の終脳にインスリン注射針を押すことで傷害を発生させる。異なる損傷後の日に、魚は自分の脳を摘出し、細胞増殖、グリア発生し、神経発生を観察するための適切なマーカーと免疫組織化学および/ またはin situハイブリダイゼーション (ISH) 内で染色され、犠牲にされています。対側非損傷半球は内部コントロールとして機能します。 RNA深いシーケンシングと例えば結合されるこの方法は、ゼブラフィッシュの大人の終脳の神経発生、再生、および修復における役割と新たな遺伝子をスクリーニングするのに役立ちます。
哺乳類は成人期中に新しい神経細胞を生成するために、非常に限られた能力を持っており、脳内の成人の神経発生は、主に側脳室の脳室下帯(SVZ)に位置する2終脳の領域に制限され、歯の下帯(SGZ)海馬1回。哺乳類には、効率的に、神経変性疾患、脳卒中、外傷に起因する脳の損傷を修復することはできません。失われたニューロンを交換せず、星状細胞、小膠細胞、およびオリゴデンドロサイトを含むグリア細胞の異なるタイプの代わりに増殖が観察される。反応性神経膠症と呼ばれるこの増殖プロセスの結果として、損傷した脳組織は、ニューロンおよび軸索再生を阻害2-4グリア性瘢痕の形成によって封止される。
哺乳類とは対照的に、ゼブラフィッシュのような硬骨魚は豊富に、成人の段階で新しいニューロンを形成し、高再生やproliferatを持っている中枢神経系2,5-7の病変を修復するために、IVEの可能性。ゼブラフィッシュ成体の脳は、全生涯8月11日の間、新しいニューロンを多数発生させる16の異なる神経幹細胞ニッチが含まれています。大人のゼブラフィッシュの脳のこれらの特定の増殖帯に生まれたニューロンは、彼らが成熟すると、既存の神経回路網8,10,12-15に統合する彼らのターゲット領域に移行します。
大人のゼブラフィッシュで同定された前駆細胞のゾーンの中では、終脳脳室帯は、最も研究され、神経幹細胞のニッチの一つです。この前駆細胞ニッチ内の細胞は、その形態、分裂速度および異なる膠細胞または神経細胞マーカーの発現に関して、三つの異なるタイプに分類することができる。 I型とII型細胞は、長いプロセスを有する細胞のような放射状グリアである。彼らは、GFAP、ネスチン、およびS100βなど、幹細胞マーカーを発現する。 II型細胞はproliferatながら、細胞が増殖しないタイプ電子徐々に、そのような細胞核抗原(PCNA)およびdesoxythymidine類似体の取り込みを増殖するなどの増殖マーカーの発現によって証明される。 III型細胞は速い神経前駆細胞になり、このようなPSA-NCAM 5,16のような神経マーカー遺伝子を発現することを約束された細胞を分裂している。
硬骨魚の再生能力が十分に文書化されていますが、ほんの数の刊行物は、損傷15,17-22に応じて大人の終脳における神経再生に関与する細胞および分子メカニズムを説明し、詳細に検討した。ゼブラフィッシュ成体の中枢神経系の再生および修復に関与するメカニズムを解読すると、構成および再生神経発生の類似点と相違点を理解するために、我々は大人の終脳損傷のゼブラフィッシュモデルを開発した。ここでは、終脳hemisphの1に傷害を発生させる視覚的方法を説明します注射針の助けを借りて、ERES、内部対照として反対非損傷側を保持したまま。また、免疫組織化学およびin situハイブリダイゼーションアッセイにおいて細胞増殖および遺伝子発現の損傷の際に変化を監視する方法を示します。
ここでは大人のゼブラフィッシュの頭蓋骨を通して針を押すことで、終脳の損傷を誘発し、免疫組織化学およびin situハイブリダイゼーションこの傷害に対する細胞および分子の反応を分析するための方法を説明します。他の既存のアプローチよりもこの技術の主な利点は、その単純さ、速度およびコスト効率である。したがって、短時間に多数の負傷脳の製造を可能にするこの技術は、容易に再生および神経発生における役割を有する遺伝子を同定するためのin situハイブリダイゼーション画面における大規模と組み合わせることができる。
損傷が施された成体ゼブラフィッシュの年齢が重要である。魚は1.5年よりも古い場合は、頭蓋骨は硬すぎて、それは頭蓋骨が押し下げられたり破断ではなく、きれいにあきている可能性があります。これとは対照的に、若い魚(4ヶ月未満の)で、LEAかもしれませんが起こって神経発生の多くは、まだある反応性の神経発生に関する偽陽性の結果をD。
このアプローチのもう一つの重要なステップは、刺し傷の効率を検証し、両半球が負傷していることを排除することです。これは、抗PCNA抗体を用いて切片を染色することによりモニターすることができる。正しく導入された病変では、PCNAは1半球の中で有意にアップレギュレートする必要があります。
これは、誘発される機械的損傷は、非特異的な細胞除去、なぜなら二次変性、炎症および血液脳関門の破壊の増加した細胞死、及び心室領域の損傷などとのようないくつかの副作用を有するであろうことに留意することが重要である脳実質への脳脊髄液の可能な結果の流れ。しかし、負傷した魚が怪我からごくわずかに苦しむように見える。 2分以内に彼らは再び自由に泳いでいると、通常の摂食行動は、約4時間以内に復元されます。 3週間後、私njuryはもう、形態学的には表示されません。私たちの手では、数百の手術から、我々は5日後に病変の組織学によって評価されるように我々は100%の負傷率を持っていたという事実にもかかわらず、単一の魚を失うことはありませんでした。
過去数年において、このようなトランスジェニックアプローチのような他の技術は、組織または細胞型特異的アブレーション2を生成するために、ゼブラフィッシュが開発されている。これらの技術は、非常にエレガントで最小侵襲的であるが、それらは複雑なDNA構築物の生成と、非常に面倒で時間がかかる可能性があり、いくつかの安定したゼブラフィッシュのトランスジェニック系統の確立に基づいています。したがって、このようなこのプロトコルに記載されたアッセイのような単純な機械的なアプローチは、成人の脳の神経発生と再生を研究するための重要なツールのまま。
The authors have nothing to disclose.
We thank N. Borel and her fish house team, M. Rastegar for help with microscopy, and T. Dickmeis for comments on the manuscript. We are grateful for support by the EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, the Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine valley (NSB-Upper Rhine) and the BMBF funded network EraSysBio.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tricaine | Sigma | 335.2 | |
10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
Glass slides | Labonord | 5305103 | |
Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
Petri dishes 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
Falcons 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
Anti-GFP (1 :1000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
Vibratome VT1000S | Leica | ||
Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | 24 | ||
Danio rerio WT strains (e.g. AB2O2) |