To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.
성인 제브라 피쉬는 부상 후 자신의 중추 신경계를 재생하는 놀라운 능력이있다. 세포 반응 및 제브라 피쉬 성인 중추 신경계 (CNS) 재생 및 수리에 관련된 분자 메커니즘을 조사하기 위해, 우리는 성인 telencephalic 부상의 제브라 피쉬 모델을 개발.
이 방법에서는, 우리는 수동으로 제브라 피쉬 성인 telencephalon로 인슐린 주사기 바늘을 밀어 상해를 생성합니다. 다른 포스트 부상 일에, 물고기는 그들의 두뇌가 밖으로 해부 및 세포 증식, gliogenesis, 그리고 신경을 관찰 할 수있는 적절한 마커를 면역 조직 화학 염색 및 / 또는 현장 하이브리드 (ISH)에 의해 더러워, 희생. 반대측 unlesioned 반구 내부 통제 역할을합니다. RNA 깊은 시퀀싱 예를 들어 조합이 방법은 제브라 피쉬 성인 telencephalon의 신경 발생, 재생 및 수리의 역할과 새로운 유전자에 대한 화면으로 도움이 될 수 있습니다.
포유 동물은 성인 생활 동안 새로운 신경 세포를 생성하는 매우 제한된 용량을 가지고 있고, 뇌의 성인 신경은 주로 측면 심실의 subventricular 영역 (SVZ)에 위치한 두 telencephalic 지역으로 제한되고, 치아의 subgranular 영역 (SGZ) 해마 1 이랑. 포유 동물은 효율적으로, 신경 퇴행성 질환, 뇌졸중, 또는 부상으로 인한 뇌의 손상을 복구 할 수 없습니다. 분실 된 신경 세포는 교체되지 않고 성상 세포, 미세 아교 세포 및 희소 돌기 아교 세포 등의 glial 세포의 다른 유형의 대신 증식, 관찰된다. 반응성 신경교 증이라는 증식 과정의 결과로서 부상 뇌 조직은 신경 세포의 축삭 재생을 억제 2-4 교세포 반흔의 형성에 의해 봉쇄된다.
포유 동물, 경골 어류는 대조적으로 제브라 피쉬와 같은 성인 단계에 풍부하게 새로운 뉴런을 형성하고 높은 재생 및 proliferat이중추 신경계 2,5-7의 병변을 복구 할 가능성을 필자. 제브라 피쉬 성인의 뇌는 전체 수명 8-11 동안 새로운 뉴런의 큰 숫자를 생성하는 16 별개의 신경 줄기 세포 틈새가 포함되어 있습니다. 성인 제브라 피쉬의 뇌의 이러한 특정 확산 영역에서 태어난 뉴런들은 성숙하고 기존 네트워크의 연결 8,10,12-15에 통합됩니다 타겟 지역으로 이주.
성인 제브라 피쉬에서 식별 원종 영역 중에서도 telencephalic 심실 영역은 대부분 연구 신경 줄기 세포 틈새 중 하나이다. 이 시조 틈새에있는 세포들은 형태, 분할 비율 및 다른 신경 교세포 또는 마커의 발현에 관한 세 가지 유형으로 분류 될 수있다. I 형과 II 형 세포는 긴 과정이 세포처럼 방사형 폐해입니다. 그들은 GFAP, 네 스틴 및 S100β 등의 줄기 세포 마커를 표현한다. 유형 II 세포가 proliferat 동안 세포가 증식하지 않는 입력전자 천천히, 휴대 핵 항원 (PCNA)과 desoxythymidine 유사체의 설립을 증식으로 확산 마커의 발현에 의해 입증. 유형 III 세포는 빠른 신경 전구 세포가 이러한 PSA-NCAM 5,16와 같은 신경 마커 유전자를 표현하기 위해 최선을 다하고 있습니다 세포를 분할됩니다.
경골 어류의 재생 능력이 잘 설명되어 있지만, 단 몇 출판물 부상 15,17-22에 대한 응답으로 성인 telencephalon에있는 신경 세포의 재생에 관련된 세포 및 분자 메커니즘을 상세히 설명하고 조사 하였다. 제브라 피쉬의 성인 중추 신경계 재생 및 수리에 관여하는 메커니즘을 해독하고 제정 및 재생 신경 사이의 유사점과 차이점을 이해하기 위해, 우리는 성인 telencephalic 부상의 제브라 피쉬 모델을 개발. 여기에서, 우리는 telencephalic hemisph 중 하나에 부상을 생성하는 시각적 방법에 대해 설명합니다주사기 바늘의 도움으로 ERES, 내부 통제 등의 반대측 unlesioned 측면을 유지하면서. 우리는 또한 세포 증식과 면역 조직 화학 염색에 의한 유전자 발현 및 현장 하이브리드 화 분석의 부상에 따라 변경 사항을 모니터링하는 방법을 보여줍니다.
우리는 여기에서 성인 제브라 피쉬의 두개골을 통해 바늘을 밀어 telencephalic 부상을 유도하고, 면역 조직 화학 염색 및 현장 하이브리드이 부상으로 세포 및 분자 반응을 분석하는 방법을 설명합니다. 다른 기존의 방식을 통해이 기술의 주요 장점은 단순성, 속도 및 비용 효율성이다. 따라서, 단시간에 많은 뇌 손상의 생산을 허용이 기술은 쉽게 재생 및 신경의 역할 유전자를 식별 반응계 혼성화 화면 대규모와 결합 될 수있다.
부상이 수행되는 성인 지브라 피쉬의 나이가 매우 중요하다. 물고기가 1.5 년보다 오래된 경우, 두개골 너무 열심히이며 두개골 아래로 밀거나 깨끗하게 천공보다는 골절되는 것이 가능하다. 어린 물고기 (미만 4 개월)에 대비,에서, 계속 신경을 많이 레아 있지 않을까합니다신경 반응에 대한 거짓 긍정적 인 결과에 D.
이 방법의 또 다른 중요한 단계는 찔린 상처의 효율성을 확인하고 두 반구가 부상하는 것을 제외하는 것입니다. 이는 항-PCNA 항체 부분을 염색하여 모니터링 할 수있다. 제대로 도입 병변에서, PCNA는 반구의 한 규제까지 – 크게해야한다.
그것은 유도 기계적인 손상 등이 아닌 특정 세포 제거, 때문에 차 변성, 염증과 혈액 – 뇌 장벽의 파괴의 증가 세포 죽음, 심실 영역의 손상 등과 같은 여러 가지 부작용이있을 것이라는 점을 명심하는 것이 중요하다 뇌 실질에 뇌척수액의 가능한 결과의 흐름. 그러나, 부상당한 물고기는 부상에서 약간의 고통을 나타납니다. 2 분 이내에 그들은 다시 자유 수영 및 일반 공급 동작은 약 4 시간 내에 복원됩니다. 후 3 주 전njury 더 이상 형태 학적으로 볼 수 없습니다. 우리 손에서 수백 수술에서 우리는 포스트 병변 오일에서 조직 학적으로 평가로 우리는 100 %의 재해율을했다 사실에도 불구하고 하나의 물고기를 잃지 않았다.
최근 몇 년 동안 이러한 형질 전환 방법과 같은 다른 기술이 조직 또는 세포 유형이 특정 절제를 생성 지브라 피쉬 개발되었다. 이러한 기술은 매우 우아하고 최소 침습하지만 그들은 복잡한 DNA 구조의 생성 및 소비 매우 지루하고 시간이 될 수있는 몇 가지 안정 제브라 피쉬의 유전자 변형 라인의 설립을 기반으로합니다. 따라서,이 프로토콜에 설명 된 분석과 같은 간단한 기계적인 접근은 성인 뇌의 신경 및 재생을 연구하는 중요한 도구가 남아있다.
The authors have nothing to disclose.
We thank N. Borel and her fish house team, M. Rastegar for help with microscopy, and T. Dickmeis for comments on the manuscript. We are grateful for support by the EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, the Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine valley (NSB-Upper Rhine) and the BMBF funded network EraSysBio.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tricaine | Sigma | 335.2 | |
10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
Glass slides | Labonord | 5305103 | |
Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
Petri dishes 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
Falcons 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
Anti-GFP (1 :1000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
Vibratome VT1000S | Leica | ||
Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | 24 | ||
Danio rerio WT strains (e.g. AB2O2) |