Imagens de fluorescência com um nanômetros Precisão (Fiona)

Summary

Fluorophores individuais podem ser localizados com precisão nanométrica usando FIONA. Aqui um resumo da técnica FIONA é relatado, e como a realização de experimentos Fiona é descrito.

Abstract

Imagens de fluorescência com uma precisão de um nanômetro (Fiona) é uma técnica simples, mas útil para localizar fluorophores individuais com precisão nanométrica no plano xy. Aqui um resumo da técnica FIONA é relatado e exemplos de pesquisas que têm sido realizados utilizando FIONA são descritas resumidamente. Em primeiro lugar, como configurar o equipamento necessário para experimentos de FIONA, ou seja, um total de microscopia de fluorescência de reflexão interna (TIRFM), com detalhes sobre o alinhamento da ótica, é descrito. Em seguida, como para realizar uma experiência simples fIONA em localizar moléculas imobilizadas com Cy3 de ADN individuais utilizando os protocolos apropriados, seguindo-se a utilização de fIONA para medir o tamanho do passo de 36 nm, de um único motor de miosina Va truncado marcado com um quantum dot, é ilustrado. Por fim, o esforço recente para estender a aplicação da FIONA para amostras espessas é relatado. Mostra-se que, utilizando uma objectiva de imersão em água e pontos quânticos embebido profundamente em sol-gel e córneas do olho de coelho (>200 mm), a precisão da localização 2-3 nm pode ser atingida.

Introduction

Por volta de 1882, Ernst Abbe descobriu que a resolução de um microscópio de luz visível é ~ λ / 2NA, ou ~ 200 nm (onde λ é o comprimento de onda e NA é a abertura numérica) ^1,2. Por conseguinte, qualquer objecto mais pequeno do que esta dimensão que aparecem como uma mancha de difracção limitada, no microscópio óptico. No entanto, é possível determinar o centro do ponto, isto é, a localização do objecto, com uma precisão muito superior ^3. Imagens de fluorescência com uma precisão de um nanômetro (Fiona) é uma técnica simples, mas útil para localizar fluorophores individuais com precisão nanométrica no plano xy ^4. A precisão da localização, _σ μ (ou seja, o erro padrão da média), depende do número total de fotões recolhidos, , Onde N é o número de fotões, s é o desvio padrão da mancha fluorescente, um éo tamanho do pixel do detector de imagens, e b é o desvio padrão do fundo ^{de 3,4.} Para um fluoróforo que emite fótons ~ 10.000, FIONA pode alcançar ~ 1 nm precisão ^4.

FIONA pode ser utilizada para determinar com precisão a posição de um emissor estacionário, ou um movimento (assumindo que as imagens podem ser feita suficientemente rápida). FIONA pode ser aplicado, sequencialmente, para os quadros do filme e, assim, controlar o movimento da única molécula ^{4 a 8.} Reagentes foto-proteção pode ser necessário garantir que a amostra não photodegrade. Além disso, o próprio objecto fluorescente pode ser de qualquer tamanho, menor ou maior do que a difracção LIMIT- por exemplo, pode consistir de um organelo (~ 1 mm) com muitas proteínas fluorescentes dispersas sobre a sua membrana. Usando FIONA ainda pode render um (nanômetros) média muito precisos de sua média de centro de massa. A grande melhoria na precisão de localização por Fiona permite resolver nanometer movimentos escala ao longo do tempo. Isso levou microscopia na escala de comprimento molecular ^{4 a 8.}

Desde a sua invenção, as variantes do fIONA têm sido desenvolvidos. Por exemplo, a imagem de campo claro com uma precisão de um nanômetro (bFIONA) ^9, uma ligeira variante da FIONA, imagens e localiza objetos densos como melanossomas in vivo (objetos escuros contendo o pigmento melanina) com luz transmitida. Além disso, fIONA tem sido empregue para resolver vários corantes. Por exemplo, uma única molécula de alta resolução de imagem com fotodegradação (camarão) ^10,11 ou uma única molécula de alta resolução co-localização (SHREC) ¹² foram desenvolvidos para resolver dois corantes dentro de cerca de 10 nm. (Note-se que esta é a resolução, ou seja, a precisão com que se pode contar corantes idênticos separados.) Mais recentemente, a análise FIONA tem contribuído para o processo de localização de certos microscopia de super-resolução, como reco óptica estocásticamicroscopia nstruction (STORM) ^{13 e 15} e microscopia de localização ativados por foto (PALM) ^16, em que fluorophores escuras temporárias está animado, e, em seguida, a fluorescência é localizada. Por várias vezes bastante interessante uma baixa densidade de corantes (menos do que um por difracção limitada local), e, em seguida, recolhendo a fluorescência, a análise de cada um deles por fIONA, pode-se construir um mapa de alta resolução. A resolução é, então, apenas limitado pelo número de fotões cada corante coloca fora, bem como coisas como manter a amostra estacionária (incluindo, por exemplo, a fase de microscópio), durante a aquisição.

Neste trabalho, um resumo da técnica FIONA e descrever brevemente exemplos de pesquisas que têm sido realizadas utilizando FIONA é relatado. Em primeiro lugar, como configurar o equipamento necessário para experimentos de FIONA, ou seja, um total de microscopia de fluorescência de reflexão interna (TIRFM), com detalhes sobre o alinhamento da ótica, é descrito. Então, comorealizar uma experiência simples FIONA em localizar moléculas imobilizadas Cy3-DNA único meio de protocolos apropriados, é ilustrado. Depois disso, o uso de fIONA para medir o tamanho do passo de 36 nm, de um único motor de miosina Va truncado marcado com um quantum dot é apresentado. Miosina Va é uma proteína motora processive essencial que transporta carga celular enquanto translocação ao longo dos filamentos de actina. Aqui uma miosina Va construir truncada é utilizado para remover os domínios irrelevantes para o tamanho do passo, e com um marcador FLAG adicionado ao terminal C para permitir a facilidade de marcação com quantum dots funcionalizados com anticorpos anti-FLAG. Esta experiência é realizada em condições de baixa ATP para abrandar a miosina e permitir a utilização de longos tempos de exposição suficiente para obter uma boa contagem de fotões em cada quadro. Qualquer marcador fluorescente suficientemente brilhante pode ser substituído no seguinte protocolo. Por fim, é relatado recente esforço de estender a aplicação da FIONA a amostras de espessura. Como princípio de prova de, pontos quânticos foram embebidosem sol-gel e córneas do olho de coelho e, em seguida, analisados ​​e localizado com Fiona. Para imagem, uma objectiva de imersão em água 60X com NA = 1.2 foi usado porque este objectivo tem uma distância maior do que trabalhar utilizado anteriormente objetiva de imersão em óleo de 100X. Para compensar a perda na ampliação da objetiva, uma lente extra-ampliação (3.3X ou 4.0X) foi inserido no caminho de emissões. Além disso, a epi-fluorescência (não TIR), microscopia precisa de ser utilizado para acesso a regiões profundas nas amostras grossas. Mostra-se que os pontos quânticos embebidos no fundo do sol-gel e em córneas do olho de coelho (Z> 200 mM) podem ser localizados com precisão 2-3 nm.

Protocol

Declaração de Ética: O tecido da córnea de coelhos foi coletado de acordo com a Universidade de Illinois Institutional Animal Care e Uso diretrizes. Configuração 1 TIRFM NOTA: Utilizar óculos de laser de segurança o tempo todo. Certifique-se de que todos os componentes ópticos necessários listados na Lista de Materiais estão disponíveis e prontos para o alinhamento. Se necessário, usar substitutos com funções equivalentes de outras empre…

Representative Results

A configuração típica TIRFM tipo objetivo é mostrado na Figura 3. Primeiro, amostra Cy3-DNA imobilizado na superfície foi fotografada. Uma imagem típica é mostrada na Figura 4a. A imagem foi feita com tempo de exposição de 0,5 seg, com ganho EM = 50 e sensibilidade CCD = 12,13 para a câmera. A função de espalhamento-ponto (PSF) de uma única molécula de DNA com Cy3 é mostrado na Figura 4b (a partir do local indicado pela seta da Figura 4-A),</stron…

Discussion

Fiona é uma técnica para localizar a posição de um emissor fluorescente (fluoróforo orgânico ou quantum dot) com precisão nanométrica e resolução temporal de até 1 ms ^{4 a 8.} Quando os fótons suficientes são coletados, esta técnica permite determinar a posição de um emissor fluorescente com muito mais precisão do que o limite de difração (~ 200 nm) e, portanto, esta técnica abre uma maneira de observar o que não tem sido visto com microscopia óptica convencional / tradicional ^{4 – 8.<…}

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Double-sided tape	3M	—	~ 75 um thick
EMCCD camera	Andor Technology	DU-897E-CS0-#BV
Ultrasonic cleaner	Branson	2510
Fluorescence filter set	Chroma	49016
Actin polymerization buffer	Cytoskeleton	BSA02
Biotin G-actin	Cytoskeleton	AB07
G-actin	Cytoskeleton	AKL95
General actin buffer	Cytoskeleton	BSA01
Laser shutter (with driver)	Electro-Optical Products Corp.	SH-10-MP
IDL	Exelis Visual Information Solutions	—
Neutravidin	Fisher Scientific	PI-31000
Coverslip	Fisherbrand	22X30-1.5	0.16-0.19 mm thick
Microscope slide	Gold Seal Microslides	30103X1	0.93-1.05 mm thick
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001
Glass bottom dish	In Vitro Scientific	D35-20-1.5-N
Cy3-DNA oligos	Integrated DNA Technologies	—	5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'Bio
Fluorescent beads	Invitrogen	T-7280
Qdot 605-streptavidin	Invitrogen	Q10101MP
Qdot605	Invitrogen	Q21301MP
Qdot705	Invitrogen	Q22021MP
Qdot705 Antibody Conjugation Kit	Invitrogen	Q22061MP
Matlab	MathWorks	—
Optical table	Newport Corp	—	RS4000 Series
60X Objective	Nikon	Plan Apo VC 60x WI
100X Objective	Olympus	PlanApo 100X/1.45 Oil ∞/0.17
60X Objective	Olympus	UPlanApo 60X/1.20W
Inverted microscope	Olympus	IX71/IX70/IX81
Origin	OriginLab	—
Anti-FLAG antibody	Sigma Aldrich	F7425-.2MG
ATP	Sigma Aldrich	A7699
BME	Sigma Aldrich	63689-25ML-F
BSA	Sigma Aldrich	A7906
BSA-biotin	Sigma Aldrich	A8549-10MG
CK	Sigma Aldrich	C3755	Creatine Phosphokinase from rabbit muscle
CP	Sigma Aldrich	P1937	Phosphocreatine di(tris) salt
DTT	Sigma Aldrich	43815	DL-Dithiothreitol
EGTA	Sigma Aldrich	E3889	Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid
HCl	Sigma Aldrich	93363-500G
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
KCl	Sigma Aldrich	P9333
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
PCA	Sigma Aldrich	03930590	Protocatechuic acid
PCD	Sigma Aldrich	P8279	Protocatechuate-3,4-dioxygenase
TMOS	Sigma Aldrich	341436-25G	Tetramethyl orthosilicate
Tris-HCl	Sigma Aldrich	93363
Trolox	Sigma Aldrich	238813	6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid
1” diameter broadband dielectric mirrors with mounts	Thorlabs	BB1-E02, KM100	Quantity: 2
½” diameter posts	Thorlabs	TR4	Quantity ≥ 6
10x beam expander	Thorlabs	BE10M-A
2” diameter broadband dielectric mirrors with mounts	Thorlabs	BB2-E02, KM200	Quantity: 2
2” diameter f = 300 mm lens with mount	Thorlabs	LA1256-A, LMR2	TIR lens
Fluorescent alignment target	Thorlabs	VRC2SM1
Laser safety goggles	Thorlabs	LG3
ND filter(s)	Thorlabs	FW1AND
Optical beam profiler	Thorlabs	BP209-VIS
Post-mounted iris diaphragm	Thorlabs	ID25	Quantity: 2
Shearing interferometer	Thorlabs	SI100
XYZ translation stage, ½” travel	Thorlabs	T12XYZ
Laser	World Star Technologies	TECGL-30	532 nm, 30 mW