Abstract
哺乳類におけるおよびキイロショウジョウバエにおける精子形成の間に、雄の生殖細胞は、本質的な発達過程の一連の開発しています。これは、幹細胞集団、有糸分裂増幅、および減数分裂の分化を含む。また、減数分裂後の生殖細胞は、劇的な形態学的再成形プロセスだけでなく、生殖クロマチンヒストン·ツー·プロタミンスイッチのグローバルなエピジェネティックな再構成を受ける。
変異誘発または他の遺伝的ツールを使用して、減数分裂後の精子形成におけるタンパク質の役割を研究することは、多くの場合、調査中で本質的な胚、前減数分裂、またはタンパク質の減数分裂の機能によって妨害されている。このようなタンパク質の変異体の減数分裂後の表現型は、以前の発達ブロックを介して目立たなくすることができ、または表現型の解釈が複雑になることができた。モデル生物ショウジョウバエは、この問題へのバイパスを提供しています：無傷の精巣をし、初期の蛹から解剖生殖細胞のさえ嚢胞は培養液中にex vivoで開発することができます。そのような培養の使用を作ることは精巣で生殖細胞を生きたと生殖系列嚢胞の顕微鏡イメージングを可能にします。重要なことは、栽培精巣および生殖細胞は、それによって減数分裂後の段階を含む、精子形成の際に酵素機能の操作を可能にする、薬理学的阻害剤にアクセス可能になる。
提示されたプロトコルは、解剖や蛹精巣および生殖系列嚢胞を育成する方法について説明します。蛹精巣および培養条件の開発に関する情報は、培養中の生きた精巣および生殖系列シストの顕微鏡用撮像データと一緒に提供される。また、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤アナカルド酸を用いて、ヒストンからプロタミンスイッチをターゲットアッセイにより例示減数分裂後の精子形成を研究するための薬理学的なアッセイを説明します。原則として、この培養法は、多くのOに対処するために適合させることができる前後の減数分裂精子形成におけるTHER研究課題。
Introduction
多くの種の雄性生殖細胞の発達は、連続プロセスである。これは、形態学的およびエピジェネティックに専門性の高い精子の形成に絶頂に達する重要な一連の事象によって特徴付けられる。 キイロショウジョウバエでは、精巣デバイドの先端の生殖系列幹細胞は非対称的に新たな幹細胞と精原細胞を生じる、 すなわち、分化に努めて娘細胞（概要については図1を参照）1,2 。精原細胞は、減数分裂の開始と、印象的な成長と転写活性の位相が精母細胞期と呼ばれる、有糸分裂の4ラウンドを受け、。 1精原細胞由来の細胞が互いに接続二つ体細胞、嚢胞と呼ばれる構造でラップされた同期化されたバンドルとして開発残る。減数分裂の完了後に、雄性生殖細胞の形態は、完全に再編成（ 図1に概略的に示される）。最初に、円形精子細胞は、流体力学的なヘッド構造を形成するために細長く、そして鞭毛を発現する。 5 -最終的に、精子細胞は、個別3と呼ばれる複雑な、アポトーシス関連機構によって互いに分離されている。
9 - キイロショウジョウバエと哺乳動物種を含む多くの種では、半数体雄の生殖クロマチンの著しいエピジェネティックな再配置を伴う生殖細胞の形態学的変化は、（HPのスイッチ）6ヒストンからプロタミンスイッチと呼ばれる。おそらくほぼすべての標準的なヒストンおよび多くのヒストン変異体分子は、DNAから取り除かれ、成熟精子のクロマチンに特有の非常にコンパクトなヌクレオプロタミンの構造が得られる小型の塩基性タンパク質、プロタミン、に置き換えられます。 HPのスイッチの一般的特徴は、Tである彼最初のヒストン変異体による、その後の移行タンパク質による、最後にプロタミンによる正規のヒストンの交換。 12 -このすべては、ヒストン脱7,10の直前に、ヒストンH4のアセチル化レベルの急増などのエピジェネティックマークにいくつかの変更が添付されています。
全てではないが大部分は、上述した処理により、成熟した、完全に稔性精子の発達に必須である。これは、哺乳類の精子形成共有として、無脊椎動物のシステム1,8,9との類似、かなりの量のショウジョウバエでなく、人間だけでなく真実である。雄性生殖細胞の発達を研究することは大いにショウジョウバエモデル系において促進される。ハエは、遺伝的に非常にアクセス可能です。突然変異体の世代だけでなく、融合遺伝子またはRNA干渉構築物を発現するハエ株の確立は、少し手間がかかります。しかし、減数分裂後の精子形成の研究では、突然変異体の使用ANdは単純な遺伝子ツールが限界に達する可能性がある。 ショウジョウバエの精子形成において、転写は、減数分裂に入ると、ほぼ完全に停止する。 16 -このように、減数分裂後の精子形成は、主に拡張された減数分裂前期13で合成され、翻訳抑制され、保存されたmRNAに基づいています。そのため、RNA干渉または非条件付き突然変異体の利用のようなツールは、具体的にも前減数分裂または減数分裂生殖細胞の開発に不可欠な機能を果たす遺伝子産物の減数分裂後の役割を研究するのに適していない。
20 -このような場合に利用することができるショウジョウバエの一つの利点は、培地4,12,17にex vivoで開発するための解剖無傷精巣および生殖細胞のさえ嚢胞の能力である。精巣や生殖系列嚢胞の切開、培養を生細胞における生殖細胞の発達だけでなく顕微鏡観察を可能にするが、そのようなヒストンアセチルトランスフェラーゼグッズ（帽子）、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）、トポイソメラーゼ、またはプロテアソームの酵素複合体の阻害剤、例えば 、薬理学的ア ッセイの使用LSO。これにより、減数分裂後の精子形成の際に酵素機能を操作するためにかかわらず、胚性減数分裂前、又は減数分裂の機能4,12の発達の結果を監視することが可能である。
薬理学的ア ッセイでは、以前に減数分裂前期中のブロモドメインタンパク質のアセチル化に依存するローカリゼーションだけでなく、帽子やHDACは12,21をターゲットに特異的な阻害剤を使用して、減数分裂後の精子形成におけるエピジェネティックなHPのスイッチのヒストンアセチル化レベルの関連性を分析した。これらのアッセイにおけるHPのスイッチを標的とすることは融合遺伝子histone2AvD-RFPと内因性パターンのprotamineB-EGFP 12,22を表現するハエ株を使用することにより可能となり、観察したこと蛹精巣の最初の精子細胞は、24および48時間APF 12の間、HPのスイッチを通過します。
提示されたプロトコルは、 ショウジョウバエの蛹、培養条件、および無傷の蛹精巣を持つ薬理アッセイからの精巣および嚢胞の解剖を説明しています。この目的のために、蛹殻形成（APF）と、約24時間で蛹の精巣を解剖している（ 図1および2を参照）。この時、精巣は他の組織への接続を行っていないと阻害剤化合物23,24によって、より良い浸透を可能にする唯一の薄い外側シースに囲まれている。精巣は簡単に文化に撮影することができBean管理や洋ナシの形の器官です。これらの精巣を培養し、解剖し、そして特異的な阻害剤で処置される。続いて、阻害剤の効果は、免疫蛍光分析し、融合タンパク質発現の蛍光顕微鏡を用いて監視され、核モルホリンの比較により未処理の生殖細胞のものと処理された生殖細胞のOGY。このプロトコルで提示条件も培養中の精巣および生殖系列嚢胞を開発するライブイメージングを可能にする。
Protocol
倫理声明：
このプロトコルに記載された実験手順は排他的にキイロショウジョウバエと協力し、ドイツの動物福祉法の対象ではありませんことを含む。
メディア、ツール、ハエの作製
- 重炭酸カリウム17なしに変更された市販の粉末のM3成長培地を準備します。注意：目や皮膚に刺激を与えます。 10％ウシ胎児血清、100 U / mlペニシリン及び100μg/ mlストレプトマイシンを含む培地を補う。最良の結果を得るための熱不活性化し、昆虫培養テスト済みウシ胎児血清を使用してください。 -20℃で一定分量が0.2μmボトルトップフィルターユニットと店舗を通じて（中と呼ぶ）完全培地をフィルタリングします。使用前に、フィルター（0.2μmのシリンジフィルターチップ）培地は再び沈殿物を除去した。
- 薬理学的アッセイのための阻害剤ストック溶液を準備します。 Dissol一定分量の適切な溶媒およびストア内の化学物質をVEの。 （：目や皮膚を刺激する。注意）のジメチルスルホキシド例えば、28.69 mMのアナカルド酸の原液を調製。
- 解剖し蛹精巣および単一の嚢胞の切開の破壊のためのツールを準備します。 2シャープで硬い針ではなく、ピンセットを使用してください。一対の鉗子の2つのアームの間に発症する毛管力は、媒体の少量の単一の嚢胞の切開を非常に困難にする。例えば、接種ループホルダーに挿入されたステンレス製の虫ピンの先端を使用しています。
- 成虫（ 約 40〜60ハエ）の十分な数の適切に熟成蛹、種子の約 10大型培養バイアル（4cmの直径を有するチューブ）を得るために。 HPのスイッチを分析するには、それらの内因性パターン12,16,22にH2AvD-RFPとProtamineB-EGFPを発現しているハエを使用しています。 25で標準条件下でバイアルをインキュベート;まで4-5日3齢幼虫のクロールされるまで、約のためのC°およびバイアル25の壁に蛹化を開始します。
2解剖のために24時間齢の蛹の入手ホワイトプリ蛹マーキングまたは収集
- HPのスイッチ上の特定の化学物質の影響をテストするために、 約 24時間のAPF 12で蛹精巣を解剖。上演蛹を取得するには、幼虫をpupatingでプリペアフライ培養バイアルを取る（セクション1.4を参照）、できるだけ多くの白人前蛹を識別します。蛹化中の一番最初のステップの間に前蛹は動かず、無給電、裏返した気門及び白色蛹殻とむしろ短くなる幼虫として表示されます。蛹殻は蛹開発26の次の段階を示しており、30〜60分以内に黄褐色になる。
- バイアルの外側に油性マジックで事前に蛹の位置をマークします。 約 24時間25℃でバイアルをインキュベートする。
- 別の方法として、PBS緩衝液で湿らせた小さなブラシでバイアルの側面から前蛹を選択します。その後、新しい50mlの反応管の側に予め蛹を転送し、 約 24時間25℃でインキュベートする。
蛹の形成後に、約 24時間で蛹精巣の3解剖
- 10cmのプラスチック製の細胞培養やシャーレ上の培地を数滴（ 約 80μlの各）を配布します。鉗子の幅広いペアまたは培地で湿らせたブラシを使用して、培養したバイアル（セクション2を参照）から24時間のAPF段階で蛹を選択します。ディッシュ上の培地の各ドロップに1さなぎを転送します。
- 解剖のために、光ファイバ照明装置を装備した実体顕微鏡を使用しています。これは、培養中の適切な発達を妨げる可能性があるため、切開中に室温より精巣を加熱しないでください。
- 5号鉗子2対の蛹を解剖。 1組では、その最も後方で蛹をつかむパート（後部気門）と位置に保持。
- 鉗子の他のペアで、前気門をつかみ、その前端で蛹蓋を開きます。胸部の少なくとも一部が露出するまで蛹のケースをはがし。
- その最も後端によって所定の位置にサナギを押し続けます。蛹の内圧を解放するには、蛹の頭部領域に鉗子の両アームを挿入します。
- 鉗子を開いて前方方向に鉗子を移動させて開いたさなぎをリッピング。この移動に伴って生成された開口部は最初の試みで、可能な限り大きいことを確認してください。これは精巣が小さい開口部から直接押され、そして最も頻繁に中断されるのを引き起こす可能性があるため、圧力が解放される前に、その後方端で蛹に損傷を与えないようにしてください。
- 蛹が開かれると、蛹の放出された内部圧力がラを通して脂肪体細胞や組織の凝集体を押したことを確認頭部領域におけるRGE開口部。蛹の精巣は、すでに本資料によって蛹から押し出されているかどうかをチェックします。これが発生する場合がある。精巣は、24時間のAPFで、他の組織に接続されていないため、蛹23から容易に排出される可能性があります。
- 彼らは蛹に残っている場合、これは精巣に損傷を与える可能性があるため、鉗子でサナギを圧迫しないようにします。鉗子の1ペアを使用して開口部のサイズを大きくします。
- そして、その最も後方の端で蛹を保持します。蛹から精巣を解放するために前方に後方から蛹の中身うち他のピンセットと静かに連勝を閉じます。
- プレカット200μlのピペットチップにそれらを引いて、精巣を収集します。精巣で転送脂肪体細胞の数を減少させるために、媒体のごく少量を転送しよう。新鮮な培養皿に培地中に精巣を配置します。少数の脂肪体細胞になるまで培地で精巣を数回洗浄するsが残っている。
- ライブイメージングのために、媒体をガラスボトム培養ディッシュに精巣を転送し、倒立イメージング顕微鏡を使用しています。薬理学的アッセイのために、ステップ5に進みます。
男性生殖細胞の嚢胞とライブイメージングの4解剖
- ガラスボトム培養皿に1つまたは複数の蛹の精巣を転送します。
- 光ファイバ照明と2つのステンレス鋼の針付き実体顕微鏡を使用して、男性の生殖嚢胞の解剖のため（1.3節を参照）。
- 一方の針を使用すると、慎重にその前方または後方端部に1つの精巣を突き止めるようにしてください。位置でそれを保持します。精巣に他の針を挿入し、横に針を移動させることにより、精巣鞘を混乱させる。嚢胞の多くは、この移動によって精巣から解放される。
- 一方の針との位置に精巣を押し続けます。他の針で精巣からの残りシストアウト優しく連勝。
- 紳士で区切り集約さ嚢胞のどちらかLYは、嚢胞のクラスタを介して、または200μlのピペットチップを用いて培地を新鮮な培養皿に嚢胞を転送することによって横に針を移動させる。
- 単一の嚢胞のライブイメージングのための倒立イメージング顕微鏡に培養皿を移動します。必要に応じて、針で再び嚢胞を分散させる。
- 位相コントラストおよび蛍光顕微鏡を使用して嚢胞の段階を特定する。
- 所望の段階の嚢胞に焦点を当てています。嚢胞は、培養皿の底に付着し、そのためピントて浮動する傾向がないように、より長いイメージング実験中に頻繁に嚢胞の焦点と位置を確認してください。
注：固定化のためのポリ-L-リジンで皿をコーティングする初期の生殖系列嚢胞の発達に有害である。その代わりに、個別の嚢胞を単離することができる。いくつかの練習で、それは非常に静かに針でそれを押すことによって、特定の嚢胞を選び出すことが可能である。これは、単一の嚢胞の転送がカルトを分離することができるようになります顕微鏡の視野に収まる引き出し先端がガラスパスツールピペットでUREの料理。単離された嚢胞がその後も容易に長期のインキュベーション後に培養皿に再配置することができる。
無傷蛹精巣を持つ5。薬理学的アッセイ
- 12回の反復の一つの実験のための培地500μlを24ウェル細胞培養プレートの各ウェルを埋める。プレカット200μlのピペットチップを用いて、各ウェルに一つの蛹の精巣を転送する。
- 倒立蛍光顕微鏡を用いて、単離された精巣におけるプロタミンの存在を確認してください。精巣は、HPのスイッチは嚢胞のいずれかで行われていないことを示していますProtamineB-EGFP信号のないものでなければならない。すでにProtamineB-EGFP陽性嚢胞を示して精巣を交換してください。
- 最初の12のウェルに、所望の最終濃度に達するように希釈した阻害剤化合物（アナカルド酸）を含有する培地500μlを追加ウェルあたり1mlの培地中で（150μM）。未処理のコントロールとして残りのウェルを使用します。阻害剤化合物と同様に使用する溶剤の同量の培地500μlを加える。注：多くの異なる化合物および溶媒を使用する場合、それはコントロールとして培地のみを使用し、別個の実験において溶媒濃度を増加さの影響を試験するために、より効率的かもしれない。
- 暗闇の中で24時間、25℃でプレートをインキュベートする。
- 上記のようにインキュベート精巣でプロタミンの存在をもう一度確認してください。制御精巣は現在、HPのスイッチを介して遷移を示す一つ以上のProtamineB-EGFP陽性嚢胞を示すべきである。
- 他の場所12,27,28説明したように200μlの先端でピペットを用いて、ポリ-L-リジンコートスライドに精巣を転送、スカッシュ準備をして、適切な蛍光抗体で染色する。
Representative Results
ショウジョウバエの雄で精巣は、既に胚に形成されており、幼虫の段階で体腔内に存続されています。 3齢幼虫ショー小さく丸い精巣将来の色素細胞の層に囲まれ、脂肪体組織（ 図2A）に埋め込 まれた。成体雄ハエにおける精巣生殖器ディスクと色素層24に由来する筋細胞の層によって覆われる長く、コイル状のチューブである。興味深いことに、幼虫の精巣は減数分裂前期に対応する一次精母細胞の段階まで、前減数分裂および減数分裂のステージのみ生殖細胞を含有する23（ 図1も参照）。雄の生殖細胞の最初のコホート蛹殻形成中に減数分裂を通過する。 約 24時間のAPFで、細長い鞭毛と減数分裂後の段階では、既に開発し、すべての核がヒストンH2AvD-RFP（ 図1および図2（b））が含まれています。精子細胞のいずれもtは受けていない彼なしProtamineB-eGFPの信号としてHPスイッチは、蛍光顕微鏡（ 図2C）によって検出することができる。多くの場合、この段階で解剖し、精巣は、オイルを数滴（ 図2C、矢印）に脂肪体細胞の凝集体または1を彷彿とさせる可変サイズの自動蛍光構造を含む。精巣内のこの構造は、位相差顕微鏡でも見えている。これまでに、文献では、その性質のいずれかの記述を見つけていない。 36時間APFで切開し精巣が長く、場合によっては既に（ 図2D）カールし始めるようである。彼らはすでに性器成虫盤23,24から成長して生殖管の組織に付着している。さらに、それらはしばしばProtamineB-eGFPの信号（ 図1および図2D、矢印）によって示されるように、HPスイッチを超えた最初の精子細胞を含んでいる。 48時間APFでは、精巣はさらに細長い持ち、明確でカーリングを開始近位端。プロタミン陽性の核を有するいくつかの生殖系列嚢胞（ 図2E、矢印）見えるようになる。
24時間APFで解剖し、精巣は24時間の培養で維持されている場合、それらは無傷のハエのように細長くしない（ '図2Dを比較し、 図6Aと図2E）。これはおそらく、通常はその後方先端23,29で精巣と連絡を開発する生殖管から送られた位置と成長シグナルの欠如によるものである。発生期の筋管が精巣24に性器ディスクから移行できないので、さらに、精巣鞘の筋層が発達しない。精巣鞘内でこのような状況は、単に薄い顔料層は、ない内生殖細胞の開発が増えてエンベロープ培養液中で十分に成長していないよう。しかし、生殖細胞は、分裂を成長させる、および精巣鞘から独立して分化する。したがって、以上の36時間後培養中のrは、初期の精巣が頻繁に破裂し、さらなる開発が観察されない。しかし、より短い時間枠内では、 図3A -3 C（また補足ビデオ1を参照）によって証明されるように、培養物中で現像エキソビボ全精巣のライブ画像を経時的に記録することができる。 約 45時間のAPFで解剖し蛹の精巣は、6時間培地中でインキュベートし、5分毎に画像化した。この時間枠内では、精子細胞のいくつかの嚢胞は、HPのスイッチ段から出てくると明るいProtamineB-EGFP信号（ 図3A '-3℃、白抜き矢印）を示している。
上述したように、 ショウジョウバエの精巣における雄性生殖細胞が相互接続された細胞の同期化されたバンドルとして開発する、という嚢胞1。 図4（a）は、約24時間のAPFで蛹の精巣から切除嚢胞の概要を示している。前減数分裂の段階、減数分裂の段階、早期減数分裂後の段階で、また前にHPのスイッチに細長い核を早期カヌー段階で嚢胞は（ 図1および図4（b）-4 E）見つけることができます。孤立した嚢胞は非常に脆弱であり、慎重に処理する必要があります。嚢胞のエンベロープを形成する2つの体細胞は、容易に機械的に破壊することができる。生殖幹細胞は生存し、 生体内で 30 の体細胞嚢胞細胞の遺伝子除去した後に分割することを継続する能力を持っている。それは、 インビトロで 、それらの体細胞エンベロープから分離16細胞期の胚細胞は、さらに19を開発し、分化することが報告されている。確かに、私たちは非常にまれではあるが、おそらく後期精母細胞が破壊嚢胞細胞と減数分裂を完了した私たちの文化系で気づいた。最も頻繁には、これらの破壊された嚢胞が開発を中止した。提示されたプロトコルに続いて、いくつかのケースでは、完全な嚢胞かもしれないがdevの72時間の最大のためのElopはex vivoで培養中の培地。しかし、嚢胞の合理的な数は、インキュベーションの48時間まで生き残ることを観察した。この時間枠内では、培養された嚢胞が減数分裂後までと同様に、HPのスイッチ12を超えた後期カヌー段階まで、ヒストンベースクロマチンと丸い核の段階から精母細胞から発生することができます。例えば、精母細胞が減数分裂に入るので、これは（ 図5及び補足ビデオ2）、精子形成に不可欠なプロセスをライブイメージングを可能にします。この実験のために、RFPタグ化ヒストンバリアントH2AvDは染色体マーカーとして使用した。精母細胞は、 インビボ 31 に約 3日間にわたって延びている。したがって、減数分裂を記録するために、私たちは目に見えてクロマチン凝縮（ 図5A、領域2）を開始した精母細胞とシストを選びました。減数分裂は、精母細胞で開始嚢胞の一方の側にしてから、残りの精母細胞に波を次の（領域2から領域1に、図5（a）の、また、 補足ビデオ2を参照）。クロマチンの凝縮はすぐに明るいスポット（ 図5A、領域2）として表示されている動きの速い染色体につながる。 30分後、この地域の最初の精母細胞が分裂終期（ 図5B、矢印）に既に存在する。若い領域1の染色体は中期板20分後（ 図5C）に配置します。彼らは完全な終期と（ 図5D）の約15分後に細胞質分裂を受ける準備ができています。分裂後期には、終期、および細胞質分裂は、この記録（ 補足ビデオ2）における約 10分間続いた。
哺乳類では、同様に、ショウジョウバエの場合と同様に、ヒストンH4のアセチル化の顕著な増加は、減数分裂後の時にヒストンの除去とHPのスイッチの開始をマークし精子形成6,11。それは、このエピジェネティック修飾が必須成分またはHPスイッチ10,32の発生プログラムの偶数トリガーであることが提案されている。以前は、私たちは阻害剤が減数分裂後の段階で12時にヒストンH4のアセチル化レベルに影響を与えるように帽子とのHDACを標的にして培養液中でショウジョウバエの蛹の精巣を治療した。これらの薬理学的アッセイでは、ヒストンアセチル化は、プロタミンベースクロマチンとステージにヒストンベースのクロマチンとの段階から精子形成の進行に必須であることがわかった。
図6および図7は、蛹の精巣でのHATを標的とするアナカルド酸を用いた薬理学的ア ッセイの代表的結果を示す。 24時間APFでの精巣はH2AvD-RFPとProtamineB-EGFPを発現しているハエ株から切開した。 ProtamineB-EGFPタンパク質は、これらの初期の蛹精巣（ 図6AおよびB）には存在しなかった。 24時間後培養中のrは、制御精巣は、まず嚢胞は、HPスイッチ（ 図6A '、オープン矢印）を超えて開発したことを示したProtamineB-EGFPシグナルを示した。これは、150μMアナカルド酸（ 図6B '）で処理された睾丸とそうではありませんでした。精巣スカッシュ製剤および免疫蛍光分析は、より詳細な情報（ 図7）を提供しています。未処理対照では、比較的大きい一次精母細胞の核は、 ショウジョウバエの主要な染色体（4Cレベル）（ 図7A、列1）に対応する豊かな染色されたDNAの3つの領域のその特徴的パターンによって認識することができる。ヒストンH4のアセチル化は、この段階（ 図7B、列1）で明らかに検出可能である。減数分裂後の最初の段階は、小核ステージとして知られており、かなり大きな、丸い核によって特徴付けられる（ 図4Cを参照して、図7に示されていない）。 図7に示す次の段階は、鞭毛の成長およびすでに初期の段階（ 図7A、列2）よりもはるかに小さく、ヒストンH4アセチル化のほぼ検出不可能なレベルに非常に低い示し生殖細胞核、ラウンド形状で識別され（ 図7B、列2）。円形その後伸長した（ 図7A、列3）、およびヒストンH4のアセチル化を再度（ 図7B、第3欄）は、明らかに検出可能である。精子細胞は、次にHPの切り替えが行われると、ヒストンがプロタミンで置換されたカヌー形のステージに到達する（ 図7A - 7 C、カラム4および5）。カヌー段階、protaminated核以下次いで、さらに成熟した精子（ここでは図示せず）に非常に細い針状に細長い。
アナカルド酸で処理精巣の精巣スカッシュ製剤は、（ 図7Dを異なる結果を示した</ strong>の- 7 F）。アナカルド酸で処理された生殖細胞におけるクロマチンは、より未処理のコントロール（ 図7D、処理され、7A、コントロールと比較）よりも凝縮されたようであった。免疫蛍光分析は、H4のアセチル化は、アナカルド酸（ 図7E）で処理された生殖細胞の核内で非常に減少、あるいは存在しないことを明らかにした。ヒストンのアセチル化を欠いているクロマチン領域は頻繁に抑圧的な構造33を示しているが、それは、高アセチル化ヒストンが開いたクロマチンの領域に関連することが知られている。したがって、アナカルド酸で処理することは、治療生殖細胞核のクロマチン構造に影響を与えたことは驚くべきことではない。重要なことは、後期カヌーステージのかを超えていないプロタミン陽性の核が治療精巣（ 図7F）で同定されなかった。このように、私たちのデータは精子があちこちに進行する。ハット活動が不可欠であるという考えと一致しているプロタミンベースのクロマチンステージにヒストンベースのクロマチンをメートル。
ショウジョウバエの精子形成の図1。概要。左側のパネルには、個別化された精子幹細胞からの生殖細胞の発達における一連のステージが表示されます。模式図は、生殖細胞の特性核の形態を示す。一つの精原細胞は1嚢胞で16相互接続された精母細胞を生成するために分割します。この段階で減数分裂後の開発に必要な転写物のほとんどは、生産翻訳抑制、および保存されます。転写活性の大部分は、減数分裂へのエントリで終了します。クロマチンにおけるヒストン·ツー·プロタミンスイッチは初期および後期カヌーステージとの間で行われる。ヒストンベースのクロマチンとのステージが高い赤で点灯。プロタミンベースのクロマチンとのステージは緑色でハイライトされています。右側のパネルのバーは、生殖通常幼虫の途上精巣で見つけることができる細胞、蛹殻形成（APF）の後に、約 24および36時間で蛹と成虫の段階を示している。
発達の異なる段階で2 ショウジョウバエ精巣図。 （A）は第三齢幼虫（L3）のわずかに押しつぶさホールマウント精巣の位相差画像。前減数分裂と減数分裂だけのステージを求めることができる。精原細胞は、ハブ地域（アスタリスク）の下の前歯の先端に制限されています。残りの精巣は、精母細胞（白矢印）が充填されている。 約わずかに押しつぶされた精巣の（B）の位相差画像蛹殻形成後24時間（APF）。精母細胞（白矢印）に加えて、精巣は成長鞭毛（ダブルオープン矢頭）でのステージを伸長ラウンド核および精子細胞で、小核のステージ（オープン矢印）に精子が含まれている（C - E）。ホールマウント蛹精巣に発現H2AvD-RFPし、 約 24時間のAPFで解剖しProtamineB-EGFP（位相コントラストおよびEGFPおよびRFP蛍光画像のオーバーレイ）。（C）蛹精巣。のグループと約 48時間のAPFでのアローヘッドは、推定脂肪体細胞の自家蛍光をマークします。D）蛹の精巣を、約 36時間のAPFで解剖し最初ProtamineB-EGFP陽性シスト（矢印）が表示されます。（E）蛹精巣ProtamineB-EGFP陽性嚢胞（矢印）。すべての図形の部分では、アスタリスクは、ハブ地域を示している。スケールバー：100μmである。ANK ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ex vivoで成長して蛹精巣におけるヒストン·ツー·プロタミンスイッチの図3。ライブイメージング。蛹殻形成（APF）の後、約 45時間後に培養液に入れH2AvD-RFPとProtamineB-EGFPを発現している蛹精巣の（A）の位相差画像。精嚢は満たされた矢印で示されている。 paragonium（二重矢印）精巣に付着したまま。（A '）（A）に示すよう精巣のEGFPおよびRFP蛍光。オープン矢印はProtamineB-EGFP陽性嚢胞を示している。スケールバー：100μmの（B）の培養液中の2時間30分後に、いくつかのさらなる嚢胞（白矢印）はFRをemergeオム追加の約後、ヒストンからプロタミン移行。（C）培養中の3時間、 すなわち、培養中の5時間29分の合計は、強いProtamineB-EGFP信号とシストのグループ（白矢印）は精巣の近位端に表示されます。また、 補足ビデオ1を参照してください。すべての図形の部分では、アスタリスクはハブ地域を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
発達の異なる段階で生殖細胞の4絶縁型嚢胞図。 （A）は嚢胞は蛹殻形成（APF）の後、約 24時間後に精巣から解剖した。位相コントラストとH2AvD-RFP蛍光（赤）画像のオーバーレイ。スケールバー：100μmである。（B - E）異なる段階の単一嚢胞の倍率は。微分干渉コントラスト（DIC）とH2AvD-RFP蛍光画像のオーバーレイ。スケールバー：小核段階での64ラウンドの精子細胞の20ミクロン（B）16精母細胞の嚢胞（C）嚢胞。小核構造が融合したミトコンドリアから開発し、核（オープン矢頭）の隣にあるDIC画像に表示されます。（D）精子細胞の嚢胞ラウンドH2AvD-RFP陽性の核とし、鞭毛（オープン矢印を長くすることに伴う伸長小核の構造を示している細長い核形状を示す初期のカヌー段階における精子細胞の嚢胞の成長軸糸）。（E）アピカル先端。広範囲に細長い鞭毛は部分的にしか表示されます。 このFの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。igure。
減数分裂を受けて単一の16精母細胞嚢胞の図5。ライブイメージング私はex vivoで H2AvD-RFPを発現し、培養中の嚢胞の。蛍光画像。図示の嚢胞における減数分裂I.精母細胞の特徴的な段階が波状で減数分裂を通過している。（A）染色体凝縮（2）嚢胞の一側核において始まり、矢印の嚢胞（方向を進む）。対向領域における核は、（1）三大染色体をマークするヒストン密集地域は依然として識別できるクロマチン凝縮、それ以前の段階を表している。地域の精母細胞（2）は明るい蛍光スポットとして見える完全に凝縮染色体を、含まれています。（B）30の後0;分、染色体凝縮地域に継続している間領域内の最初の精母細胞（2）、終期（開いた矢印）である（1）〜（C）領域の最後の精母細胞（1）において、染色体（矢印）が配置されている。さらに15分以内に、中期板20分後。（D）で、最後の精母細胞は終期を完了しているように見え、今細胞質分裂（オープン矢じり）を受ける準備ができています。 。また、 補足ビデオ2スケールバーを参照してください。50μmのこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6アナカルド酸は、培養蛹精巣におけるヒストン·ツー·プロタミンスイッチを阻害する。蛹がexpressi精巣 （（DMSO、ジメチルスルホキシド; 'A、A対照）または150μMのアナカルド酸を添加した培地でNG H2AvD-RFPとProtamineB-EGFPと蛹殻形成後24時間目に解剖し（APF）は、阻害剤を含まない培地中で24時間培養したB、B '）。ハブ領域は、星印で示されている。（A、B）いいえProtamineB-EGFP陽性嚢胞は解剖後に観察することができます。（A '）インキュベーションの24時間後に、いくつかの嚢胞がヒストンからプロタミンスイッチとProtamineB-EGFP陽性を受けた嚢胞（オープン矢頭）が観察できる。（B '）アナカルド酸で処理精巣がProtamineB-EGFP陽性嚢胞を発症しない。スケールバー：100μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図7アナカルド酸はヒストンH4のアセチル化および精子細胞のクロマチン構造に影響を与える蛹精巣から精子細胞の核ProtamineB-EGFPを発現している（24時間APF）は阻害剤（A - C）なしで24時間インキュベートのスカッシュの準備を。または150μMのアナカルド酸と（D - F）。 DNAをヘキスト色素（A及びD）で染色した。 H4のアセチル化は、（BとE）免疫蛍光分析した。 ProtamineB-EGFP信号（CとF）でモニタープロタミンの存在。アナカルド酸で処理した後、クロマチンを強く（D）に圧縮表示さ及びH4のアセチル化信号は、完全にすべての精子細胞の段階（E）に低減される。また、アナカルド酸は、処理された精巣は、後期カヌーステージのかを超えていない嚢胞なしProtamineB-EGFP信号（F）を示さない。スケールバー：10μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
補足ビデオ1。6時間の時間経過イメージングのex vivoでビデオに成長蛹精巣におけるEGFPおよびヒストンからプロタミンスイッチのRFP蛍光を介したライブイメージングは ProtamineB-の有病率の増加によるヒストンからプロタミン推移を示すEGFP陽性嚢胞。画像は5分毎に取得した。詳細については、 図3を参照してください。（ダウンロードの下に「suppl_video_1.MOV」を参照してください）。
補足ビデオ減数分裂を受けて単一の16精母細胞シスト0002ライブイメージングI ex vivoで 。のタイムラプス蛍光イメージング80分かけH2AvD-RFPを発現し、培養中の嚢胞。このビデオでは、減数分裂Iを画像の特徴的なステージが1分ごとに取得した描写。詳細については、 図5を参照してください。（ダウンロードの下に「suppl_video_2.MOV」を参照してください）。
Discussion
提示されたプロトコルは、特定の発達段階でのショウジョウバエ精巣および単一生殖細胞嚢胞を分析する能力に、培養皿の中でこれらの細胞および組織のex vivoでの開発の両方に基づいて、2つの異なるアプリケーションを記述します。一つの用途は、精子の発達中の重要なプロセスの薬理学的操作である。重要なことは、これは簡単にハエ遺伝学に基づいて機能解析を使用して得られていません減数分裂後の精子形成へのアクセスを可能にする。他のアプリケーションが生きていると生殖細胞および精巣の開発の顕微鏡観察である。 RTで、通常の雰囲気下で生き残り、発展させる培養中のショウジョウバエの細胞や臓器の能力から、特にこのアプリケーションの利点。したがって、加熱されたステージ（25℃の標準的育種温度に加熱）を装備した倒立イメージング顕微鏡はライブイメージング実験に意味のある結果を得るのに十分である。さらなるライブイメージングのための蛍光タンパク質タグ付きタンパク質を発現するより、多くのトランスジェニックハエ株は存在しないか、容易に確立することができる。
蛹の精巣または特定の発達段階の生殖嚢胞を得るためには、一つは、ショウジョウバエの発達のタイミングに精通していることが重要です。各ステージの正確なタイミングは、実験室の中で培養条件を変化させると、株を飛ぶ、経験的に確立されなければならない場合があります。上記で概説したように、これは、例えば、HPスイッチを標的、薬理学的アッセイにとって特に重要である。タイミングが一つでも集団内でわずかに変化することができますので、このような実験のために、それは常に、実際の阻害剤試験前ProtamineB-EGFP信号と精子細胞を確認することをお勧めします。
上記のプロトコルに続いて、添付の脂肪体組織の自由な無傷の器官として初期の蛹の段階から精巣を解剖するために、実験を有効にする必要があります。これらの精巣および、なおさら、孤立したGERM-ライン嚢胞は非常に壊れやすいものです。したがって、鉗子、針、およびピペットを用いて精巣および嚢胞を処理し、転送するのに必要な手先の器用さと経験を開発することが重要です。特に減数分裂および初期減数分裂後の生殖細胞発達を標的とする研究は、この恩恵を受ける。それは成人の精巣から長い鞭毛後期精子細胞の嚢胞を分析することは比較的容易であるが、それは初期段階を得ることが困難である。このプロトコルに従って、初期の蛹の精巣からこれらの嚢胞を解剖すると、はるかに効率的です。通常のハエ株で、蛹のわずか約 50％が男性であることに留意してください。そのため、必要な精巣の数と、少なくとも倍の蛹を解剖するための準備。或いは、精巣無傷幼虫23,34の横方向の脂肪体組織に埋め込 まれたような半透明の円形の器官を同定することができるように、立体顕微鏡を用いて雄L3幼虫を識別するために、新鮮な培養バイアル中にそれらを収集することが可能であること缶ステージングおよび解剖のための前蛹を選択するために使用される。それは、男性のプレ蛹35を識別することも可能である。
また、以前に18報告されている単離された生殖嚢胞や文化にそのまま蛹精巣の両方が、光に敏感であることに気づいた。この光感度も薬理学的アッセイで使用されるいくつかの化合物のために保持しているかもしれません。したがって、インキュベーションの間に暗闇の中でアッセイの培養皿を維持することが最善です。開発精巣および、とタイムラプスイメージング実験を計画する際に同様に、特に、孤立した嚢胞は、あまりにも長い露光時間および/ またはすぎる高いサンプリングレートはex vivoでの開発を阻害する可能性に留意してください。適切なサンプリングレートは、実験的に決定されるべきである。
培養皿中の細菌および/または真菌感染症および過成長が深刻な問題となる。あまりにも多くの細菌に感染した培養皿は、ex vivoで DEVEをサポートしていません精巣および嚢胞のlopment。したがって、記載の培養培地は（ステップ1.1参照）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むが、長期のインキュベーションの間に、これらの抗生物質が低下する可能性があり、それらの活性が減少するかもしれない。これは、上記のプロトコルを使用した場合に観察培養した嚢胞の生存の限られた時間の理由の一つ（最大72時間）である可能性があります。まだこの時間枠は、皿中の培養培地を定期的に交換することによって拡張することができなかった。私たちは、他の要因がそのような生殖管の他の組織からの増殖シグナルの欠如として、培養中の生存に影響を与えるかもしれないと結論付けている。一方、減数分裂後の開発は、哺乳動物におけるよりもショウジョウバエの高速です。 ショウジョウバエでは、精子は、約90時間を要し、HPのスイッチは、減数分裂9,12後に50〜60時間の間で行われる。このように、このプロトコルを用いて達成周り48時間の通常の生存時間はSPEにおいて極めて発達過程に従うことが非常に適しているそのような減数分裂またはHPのスイッチとしてrmatogenesis、。細菌や真菌の汚染がきれいなツールやメディアを使用することで回避できますが、提示されたプロトコルは、ハエのため、厳密に無菌労働条件を利用し、標準的な条件下で飼育するとき睾丸は既に細菌が含まれて飛ばない。それにもかかわらず、この培養技術のいくつかのアプリケーションは、（プロトコルのために、17,36,37を参照）無菌条件下で解剖したり、隆起したハエの恩恵を受ける可能性があります。
薬理学的アッセイは、さまざまな酵素の阻害剤または活性化因子として機能する化学化合物の使用に依存します。一般的にこのような実験において使用される化合物は、しばしばそれらの標的特異性が大きく異なる。利点としては、これは、アナカルド酸阻害P300 / CBP、PCAF、帽子38のMYSTファミリーのメンバーと、例えば、全体の酵素クラスをターゲットにする可能性を提供しています。これの欠点は、潜在的なオフターゲットまたは細胞傷害効果inducかもしれないそのような化合物によって編したがって、蛹精巣や嚢胞を用いたアッセイで使用される各化合物は、その細胞毒性及び異なる濃度で特定の効果をテストする必要があります。また、培養条件、化合物濃度または活性、および細胞透過性の変化に多少のばらつきが誘導される効果のばらつきにつながるかもしれない。したがって、各実験における治療の成功を監視する必要がある。私たちは、150μMでアナカルド酸を使用した場合に、ヒストンH4のアセチル化は一貫して減少している間たとえば、私たちは、間に、時にはいくつかの精巣内のクロマチン凝縮表現型の強度に多少の変動を観察した。
培養物中のショウジョウバエ精巣で薬理学的ア ッセイは、精子形成4,12,14,21の前後の減数分裂のメカニズムを分析するために使用されてきた。それはエッセンで選手を標的とするために、遺伝的ツールで減数分裂後の精子形成にアクセスすることは困難であるためLの前減数分裂と減数分裂の機能は、このex vivoでのアプローチは、代替手段を構成している。また、原理的には、本方法は、経時的な処置生殖細胞の発達を追跡するパルスチェイス実験に適合させることができる。しかし、私たちはまだこの可能性をテストしていません。初期の蛹精巣の使用を作ることは薬理学的アッセイで有利である。まず、（24時間APF前後）若い蛹精巣の薄い外側シースは、化合物の改善された透過性を可能性があります。減数分裂後のHPのスイッチを研究するときに、第2、蛹精巣は、HPのスイッチには影響されたかどうかを直接読み出しを可能にするプロタミン-GFP発現フライラインから24時間のAPFで解剖した。
現在までのところ、精巣および生殖系列嚢胞を含むショウジョウバエの器官や組織のex vivo培養のためのいくつかのプロトコルが開発されている（ 例えば 、4,14,17,20,39,40を参照のこと）。培養培地および使用される一般的な条件1979年に設立されたここで紹介するプロトコルで17。培養系は、後に成人の精巣4から分離された後期減数分裂後の嚢胞で個別化機構のin vivoイメージングに適合させた。以前は、私たちはこれらの条件はまた、周りの48〜12時間のために彼らの嚢胞で減数分裂や早期減数分裂後の生殖細胞の生存と分化を支持することを報告した。他の培養システム19とは対照的に、これらの培養物において観察された発生のタイミングは（詳細については、12を参照） を固定したサンプルから決定されたタイミングとほぼ一致した。 H2AvD-RFPおよびプロタミン-GFP蛍光シグナルは培養中の生殖細胞の核形態およびクロマチン組成物を可視化するために使用することができる。私たちは、培養中の発達段階の明確な識別のために、このような嚢胞のコイリングなどの他の基準、より有利であることがわかった。重要なことは、提示されたプロトコルは、フライ内線の添加を伴わないウシ胎児血清以外RACTまたは他の増殖因子。さらに、本 発明者らは、条件がエキソビボ培養における減数分裂の蛍光顕微鏡画像と互換性があることをここに示す。画像は、長期的発展をサポートする使いやすい培地中で妥当な解像度を得ることができる。これはVoltalef油41,42に短期間（ 約 3時間）の観察を可能にするプロトコルとは対照的である。
栽培や蛹精巣およびシングル男性生殖嚢胞の薬物治療のための上記の手順は、 ショウジョウバエの精子形成に研究することができる多くの遺伝的、エピジェネティックな、生物学的細胞、または発生の質問に簡単に適応可能である。これは、生殖系列幹細胞に着目し、特に研究を含む。それは、20,43精巣幹細胞の発達を培養成体のライブイメージングを続けることができることが示されている。しかし、成熟した精巣の蠕動運動sheathは画像取得を妨害する。したがって、いずれの画像化は、断片化精巣43または行わイメージング実験の数は、失われたデータセット20を考慮して大きくする必要があるを使用して行われる。初期の蛹精巣（24時間APF）は、まだ筋肉細胞に同封されていません。でも、少し古い精巣（36-45時間のAPF）は、いくつかの蠕動運動を表示します（ 図3、補足ビデオ1を比較する）ように見える。したがって、無傷の臓器若い蛹精巣の栽培は、代替となりうる。
また、一度、蛹精巣を分析するために、最終的には孤立した生殖細胞嚢胞が小さく、細胞集団にもかかわらず、均質の源として、単一の嚢胞を使用してさらなる応用を可能にする能力を習得。すでに実証されているように、例えば、それは、精子形成の定義された段階において特定遺伝子の転写調節を分析するためにRT-定量PCRを実行することが可能である
Disclosures
著者らは競合する利益を有していない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anacardic acid | Merck Millipore | 172050 | brand: Calbiochem (EMD Millipore) |
| Anti-acetyl-Histone H4 | Merck Millipore | 06-598 | brand: Upstate |
| AxioCam MRm | Zeiss | ||
| AxioObserver.Z1 inverted microscope | Zeiss | ||
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Dumont 5-Inox forceps | Dumont | multiple suppliers | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Sigma | F4135 | |
| Fiber optical illuminator | multiple suppliers | ||
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5 | Dianova | 711-175-152 | |
| Hoechst | Sigma | B1155 | |
| Inoculation loop or pin holder | multiple suppliers | ||
| Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0 | Plano GmbH | N5018 | In our hands both of these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter. |
| Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm | Plano GmbH | N5014 | |
| Multiwell plates, 24-wells | Becton Dickinson | 351147 | brand: Falcon |
| Pen Strep | invitrogen | 15070 | brand: Gibco |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma | S8398 | |
| Stemi SV6 binocular | Zeiss |
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