Histolojik ve Fonksiyonel Özellikleri: Methylnitrosourea (MNU) Retina Dejenerasyonu ve Rejenerasyon Zebra balığı -kaynaklı
Summary
Bu yazıda retina de- ve rejenerasyon ve yetişkin zebrabalıkları N-metil-N -nitrosourea kullanarak görme fonksiyonu üzerindeki etkisinin ölçümü göstermektedir. Görme keskinliği kaybı ve azalmış fotoreseptör numaraları iç nükleer tabakada çoğalması ile takip edildi. Komple morfolojik ve fonksiyonel rejenerasyon 30 gün ilk tedaviden sonra meydana geldi.
Abstract
Endüstriyel dünyada görme kaybının çoğunluğu için fotoreseptör hasar hesabı ile sonuçlanan retina dejeneratif hastalıklar, örneğin retinitis pigmentosa,. Hayvan modelleri, bu tür hastalıkları incelemek için temel bir öneme sahiptir. Bu bağlamda, N-metil-N -nitrosourea (ÇUB) yaygın olarak kemirgenlerde kullanılmıştır fotoreseptör spesifik toksin farmasötik olarak retina dejenerasyonuna tetiklemek için karıştırılabilir. Daha önce, Zebra balığı bir MNU kaynaklı retina dejenerasyonu modeli, görsel araştırmalar başka popüler model sistem kurduk.
Memelilere büyüleyici bir fark yetişkin zebrabalıkları retina ve hasar sonra rejenerasyon kalıcı nöron olduğunu. Biz yetişkin zebrabalıkları görme keskinliği ölçümleri istihdam var bu gözlemi ölçmek için. Böylece, optokinetik refleks olmayan anestezi balık fonksiyonel değişiklikleri izlemek için kullanılmıştır. Bu immünhistokimyasal staini yanı sıra histoloji ile takviye edildiapoptosis için ng (TÜNEL) ve çoğalması (PCNA) gelişmekte morfolojik değişiklikler ilişkilendirmek için.
Özet olarak, fotoreseptör apoptoz üç gün dış çekirdek katmanında (ONL) hücrelerin belirgin bir azalma izler ÇUB tedaviden sonra ortaya çıkar. Bundan sonra, iç nükleer tabaka (INL) ve onl hücre çoğalması gözlenmiştir. Burada, bir tam histolojik kalmaz, aynı zamanda etkin bir yenilenmesi, 30 günlük bir süre boyunca oluşturduğunu ortaya koymuştur. Şimdi ölçmek ve video formatında MNU kullanarak Zebra balığı retina DE- ve yenilenmesini takip yöntemleri açıklamaktadır.
Introduction
Vizyon insan için en önemli duyu ve değer düşüklüğü, yüksek sosyo-ekonomik etkisi vardır. Gelişmiş dünyada, retina dejeneratif hastalıklar yaşlı yetişkinler 1 arasında görme kaybı ve körlük önde gelen nedenidir. En dejeneratif retina hastalıklarının nedeni kısmen anlaşılır ve tedavi çözümleri kayıp vizyon kazanmak için çok sınırlı. Retinitis pigmentosa N -nitrosourea (ÇUB), retinal dejenerasyon meydana metiltio, primer fotoreseptör kaybı 2-3. N retinal dejeneratif bir hastalığın tipik bir örneğidir ve bu nedenle yaygın primer fotoreseptör hücre ölümü ile 4 hastalıkların modellemek için kemirgenlerde kullanılır. Bu bir alkilleyici madde ve genellikle 5-7 maruz bir kaç ay sonra görünür huylu ve kötü huylu tümörler, yol açar. Buna ek olarak, kısa süreli bir gözlem süresi içinde özel bir fotoreseptör hücre ölümüne neden olur. Böylece, retina tabaka Yapıdaki kaybıre ve anlamlı bir retina incelmesi konsantrasyona bağlı bir şekilde tespit edilmiştir. Retina glia hücreleri aktive edildi, ancak retina pigment epiteli (RPE) hiçbir değişiklik bulundu. Endoplazmik retikulum (ER), stres ile ilgili apoptoz retinada 8 ÇUB etkisinin en temel bir yol olarak görünmektedir.
Biz son zamanlarda Zebrafish 9 fotoreseptör dejenerasyonu ikna etmek için bir kimyasal model olarak MNU girmiştik. Diğer nedenler arasında, Zebra balığı (Br.rerio) çünkü diğer omurgalıların 10 o kendi görsel sistemin benzerlikler görsel araştırma önemli hale gelmiştir. Dış retina ultraviyole, kısa, orta tepe hassasiyetleri ve görünür spektrumu uzun dalga boyu ve bir çubuk fotoreseptör türüyle dört farklı koni gruba ayrılabilir olabilir fotoreseptörleri içerir. Iç nükleer tabaka (INL) olarak, bipolar, yatay ve amacrine internöron hücre gövdeleri, wel olarak bulunurlarMuller, glia hücreleri, hücre soma olarak L.. Dış pleksiform katman (OPL) içinde fotoreseptör ve iç retina arasındaki sinaptik iletişim lensin en yakın hücre tabakası ise optik sinir ve optik sistemini içeren uzun aksonlar oluşturan bileşenler ve ganglion hücre tabakası (GC) olan oluşturulmaktadır . Salgı bezleri ve iç nükleer tabakadaki hücrelerin arasında olduğu, sinaptik temasların olarak iç pleksiform tabakasındaki (IPL) 11 oluşur. RPE nörosensöriyel retina dışında yer alır ve uzun apikal mikrovilluslu 12 ile fotoreseptör dış segmentleri çevreler. Ayrıca, Zebrafish yüksek rejeneratif ve lezyonlu beyin, retina, omurilik, kalp ve diğer dokuları 13 yetiştirmeleri için yapabiliyor. Retinal hasar oluştuğunda, Muller hücreleri olduğu düşünülmektedir INL hücreleri, aktive edilmiş ve çeşitli retinal hücre tipleri içine ayırt etmek için bir potansiyele sahiptir. Buna ek olarak, aynı zamanda ONL bulunan çubuk progenitörlerle üretir. Başka bir nedenleYeni hücreler ile yetişkin zebrafish retina malzemeleri urce siliyer marjinal bölgesidir. Bu kaynak, sürekli olarak büyüyen Zebrafish göz 14 çubuk fotoreseptör sabit bir yoğunluğu elde etmek için gereklidir.
ÇUB modeli retina dokusu için basit ve tekrarlanabilir bir dejenerasyon / yenilenmesi yaklaşımı olarak da kullanılabilir. Nedeniyle Zebra balığı biyolojik süreçler bazı benzerlikleri ve insanlarda bu ilgili hücre ölümü yolları belirlemek için kapıları açmak ve potansiyel nöroprotektif ilaç ekrana. Bizim gruptan bir önceki çalışmaya göre, biz şimdi retina de- ve laboratuvar videoları 9 uygun fonksiyonel değişiklikler dahil olmak üzere izleyen rejenerasyon bu MNU kaynaklı zebrabalıkları modelinin yöntemlerini göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Daha önce, bizim grup Zebrafish sistemine 9 içine kemirgenler fotoreseptör dejenerasyonu MNU modelini transfer etti. Takip eden olaylar anlatılmış ve 30 güne kadar takip edildi. Bu süre içinde tam retina morfolojik dejenerasyon ve rejenerasyon ilk tedaviden sonra meydana geldi. İlk olarak, histoloji azalmış bir çubuk hücre Buna 8. günde en az on gün 3 saymak ortaya, TUNEL boyama 3 gün MNU tedaviden sonra çubuk fotoreseptör apoptozisini tanımlar. Rejenerasyon Prolifere eden hücreler, bu ç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Monika Kilchenmann, Federica Bisignani and Agathe Duda for their excellent technical assistance.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A6283 | |
| Ammonia | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 294993 | 0.80% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 05470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 45260 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | 100%, 96%, 70% |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | E10521 | Tricaine |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11012 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 320331 | 0.20% |
| In situ Cell Death Detection Kit | Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland | 11684795910 | TUNEL Kit |
| Mayer's hemalum solution | Merck, Darmstadt, Germany | 109249 | |
| Methylnitrosourea (MNU) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | N4766 | Toxic |
| OptoMotry | CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada | n.a. | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Proteinase K | Dako, Glostrup, Danmark | S3004 | |
| Rabbit anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA | sc-33756 | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| TrizmaÒ base | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | T1503 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain | University of Fribourg, Dept. of Biology | n.a. | Own fish facility |
References
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Bhatti, M. T. Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, and neurologic diseases. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 6 (5), 403-413 (2006).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
- Tsubura, A., Yoshizawa, K., Kuwata, M., Uehara, N. Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials. Histol. Histopathol. 25, 233-248 (2010).
- Machida, K., Urano, K., Yoshimura, M., Tsutsumi, H., Nomura, T., Usui, Carcinogenic comparative study on rasH2 mice produced by two breeding facilities. J. Toxicol. Sci. 33, 493-501 (2008).
- Morton, D., et al. N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU): A positive control chemical for p53+/- mouse carcinogenicity studies. Toxicol. Pathol. 36, 926-931 (2008).
- Terracini, B., Testa, M. C. Carcinogenicity of a single administration of N-nitrosomethylurea: a comparison between newborn and 5-week-old mice and rats. 24, 588-598 (1970).
- Zulliger, R., Lecaudé, S., Eigeldinger-Berthou, S., Wolf-Schnurrbusch, U. E. K., Enzmann, V. Caspase-3-independent photoreceptor degeneration by N-methyl-N-nitrosourea (MNU) induces morphological and functional changes in the mouse retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 859-869 (2011).
- Tappeiner, C., et al. Characteristics of rod regeneration in a novel zebrafish retinal degeneration model using N-methyl-N-nitrosourea (MNU). PLOS One. 12, (2013).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. 19, 621-629 (2001).
- Fleisch, C., Neuhauss, S. Visual Behavior in Zebrafish. Zebrafish. 3, 191-201 (2006).
- Hodel, C., Neuhauss, S. C. F., Biehmaier, O. Time course and development of light adaptation processes in the outer zebrafish retina. InterScience. 288, 653-662 (2006).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
- Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. Genetics of photoreceptor degeneration and regeneration in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. 68, 651-659 (2011).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C., Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , 7-38 (2002).
- Tappeiner, C., Gerber, S., Enzmann, V., Balmer, J., Jazwinska, A., Tschopp, M. Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish. Front. Zool. 9 (1), 10 (2012).
- Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp. Eye Res. 91, 601-612 (2010).
- Nelson, C. M., Hyde, D. R. Müller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).
- Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 45 (12), 4611-4616 (2004).
- Beck, J. C., Gilland, E., Tank, D. W., Baker, R. Quantifying the ontogeny of optokinetic and vestibulo-ocular behaviors in zebrafish, medaka, and goldfish. J. Neurophysiol. 92 (6), 3546-3561 (2004).
- Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of Inner Retinal Neurons after Intravitreal Injection of Ouabain in. Zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
- Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
