Methylnitrosourea (MNU) indotta retinica degenerazione e rigenerazione in Zebrafish: istologica e Caratteristiche Funzionali
Summary
Qui dimostriamo quantificazione dei de- retina e la rigenerazione e il suo impatto sulla funzione visiva con N -methyl- N -nitrosourea in zebrafish adulto. Perdita di acuità visiva e diminuito il numero dei fotorecettori sono state seguite dalla proliferazione nello strato nucleare interno. Completa rigenerazione morfologica e funzionale si è verificato 30 giorni dopo il trattamento iniziale.
Abstract
Malattie degenerative della retina, ad esempio, retinite pigmentosa, con conseguente danno conto fotorecettore per la maggior parte della perdita della vista nel mondo industriale. I modelli animali sono di fondamentale importanza per lo studio di tali malattie. A questo proposito la tossina specifica-fotorecettore N -methyl- N -nitrosourea (MNU) è stato ampiamente utilizzato nei roditori per indurre farmacologicamente degenerazione retinica. In precedenza, abbiamo stabilito un modello di degenerazione retinica MNU indotta in zebrafish, un altro sistema modello popolare in ricerca visiva.
Una differenza affascinante per i mammiferi è la neurogenesi persistente nell'adulto retina zebrafish e la loro rigenerazione dopo un danno. Per quantificare questa osservazione abbiamo impiegato le misure di acuità visiva in zebrafish adulto. In tal modo, il riflesso optocinetica è stata utilizzata per seguire i cambiamenti funzionali nei pesci non anestetizzato. Questo è stato integrato con istologia e immunoistochimica staining per apoptosi (TUNEL) e la proliferazione (PCNA) di correlare i cambiamenti morfologici in via di sviluppo.
In sintesi, l'apoptosi dei fotorecettori avviene tre giorni dopo il trattamento MNU, che è seguita da una marcata riduzione delle cellule nello strato nucleare esterno (ONL). Successivamente, la proliferazione delle cellule nello strato nucleare interno (INL) e ONL si osserva. Qui, ci rivelano che non solo istologica completa, ma anche una rigenerazione funzionale si verifica nel corso di un corso di 30 giorni. Ora si illustrano i metodi per quantificare e seguire zebrafish de- retina e rigenerazione utilizzando MNU in un video formato.
Introduction
Vision è il senso più essenziale per l'essere umano e la sua perdita di valore ha un elevato impatto socio-economico. Nel mondo sviluppato, le malattie degenerative della retina sono la principale causa di perdita della vista e cecità tra gli adulti più anziani 1. La causa della maggior parte delle malattie degenerative della retina è solo parzialmente compreso e soluzioni terapeutiche per recuperare la vista perduta sono molto limitate. La retinite pigmentosa è un tipico esempio di una malattia degenerativa della retina con perdita dei fotorecettori primaria 2-3. N -methyl- N -nitrosourea (MNU) induce degenerazione retinica e quindi è ampiamente usato nei roditori per modellare malattie con fotorecettori primaria morte cellulare 4. Si tratta di un agente alchilante e porta a tumori benigni e maligni, che di solito compaiono diversi mesi dopo l'esposizione 5-7. Inoltre, provoca la morte cellulare dei fotorecettori specifica entro un periodo di osservazione di breve termine. In tal modo, la perdita dello strato structu retinare e significativo assottigliamento della retina sono stati osservati in maniera concentrazione-dipendente. Cellule gliali retiniche sono stati attivati, ma non sono state trovate variazioni nel epitelio pigmentato retinico (RPE). Reticolo endoplasmatico (ER) apoptosi legati allo stress sembra essere la via principale di azione MNU nella retina 8.
Abbiamo recentemente introdotto MNU come modello chimico per indurre degenerazione dei fotorecettori in zebrafish 9. Tra le altre ragioni, il pesce zebra (Danio rerio) è diventato importante nella ricerca visiva a causa della somiglianza del suo sistema visivo a quello di altri vertebrati 10. La retina esterna contiene i fotorecettori, che possono essere raggruppati in quattro diversi tipi di coni con sensibilità di punta in nell'ultravioletto, a breve, medio e lungo lunghezze d'onda dello spettro visibile e una canna tipo di fotorecettori. Nello strato nucleare interno (INL), i corpi cellulari dei bipolari, orizzontali, amacrine e interneuroni si trovano, come well come il soma cellulare delle cellule gliali Muller. Nello strato plessiforme esterno (OPL) si formano i contatti sinaptici tra fotorecettori e la retina interna, mentre lo strato di cellule più vicino alla lente è lo strato di cellule gangliari (GC), quali componenti formano lunghi assoni che costituiscono il nervo ottico e delle vie ottiche . Contatti sinaptici tra le cellule gangliari e le cellule nello strato nucleare interno si formano nello strato plessiforme interno (IPL) 11. La RPE si trova al di fuori della retina neurosensoriale e circonda i segmenti esterni dei fotorecettori con lunghi microvilli apicale 12. Inoltre, il pesce zebra è altamente rigenerativa e in grado di far ricrescere cervello lesionato, retina, midollo spinale, cuore, e di altri tessuti 13. Quando si verifica un danno retinico, le cellule del INL, che si pensa siano le cellule Müller, sono attivati e hanno il potenziale di differenziarsi in vari tipi di cellule retiniche. Inoltre, essi generano anche progenitori asta, che si trovano nella ONL. Un altro modopubblico Fonte che alimenta la retina di zebrafish adulto con nuove cellule è la zona marginale ciliare. Questa fonte è necessaria per ottenere una densità costante di bastoncelli nel zebrafish continua crescita dell'occhio 14.
Il modello MNU può essere utilizzato come un approccio semplice e riproducibile degenerazione / rigenerazione di tessuto retinico. A causa di alcune somiglianze di processi biologici in zebrafish e negli esseri umani questo potrebbe aprire le porte ad individuare percorsi di morte cellulare coinvolti e per lo screening potenziali farmaci neuroprotettivi. Sulla base di un precedente studio del nostro gruppo, che ora illustreremo i metodi di questo modello zebrafish MNU indotta di de- retina e conseguente rigenerazione compresi i cambiamenti funzionali con funzione video laboratorio 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
In precedenza, il nostro gruppo ha trasferito il modello MNU di degenerazione dei fotorecettori dai roditori nel sistema zebrafish 9. Gli eventi successivi sono stati descritti e seguiti fino a 30 giorni. In questo periodo di tempo completa degenerazione morfologica della retina e la rigenerazione avvenuti dopo il trattamento iniziale. In primo luogo, istologia rivela una conta di cellule asta ridotto da 3 giorni su con un minimo al giorno 8 Corrispondentemente, TUNEL colorazione identifica l'apoptosi dei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Monika Kilchenmann, Federica Bisignani and Agathe Duda for their excellent technical assistance.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A6283 | |
| Ammonia | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 294993 | 0.80% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 05470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 45260 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | 100%, 96%, 70% |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | E10521 | Tricaine |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11012 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 320331 | 0.20% |
| In situ Cell Death Detection Kit | Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland | 11684795910 | TUNEL Kit |
| Mayer's hemalum solution | Merck, Darmstadt, Germany | 109249 | |
| Methylnitrosourea (MNU) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | N4766 | Toxic |
| OptoMotry | CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada | n.a. | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Proteinase K | Dako, Glostrup, Danmark | S3004 | |
| Rabbit anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA | sc-33756 | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| TrizmaÒ base | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | T1503 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain | University of Fribourg, Dept. of Biology | n.a. | Own fish facility |
References
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