組織学的および機能的特性：メチルニトロソ尿素（MNU）は、網膜変性·再生ゼブラフィッシュでの誘発
Summary
ここで私たちは、網膜変性および再生及び成人のゼブラフィッシュにおけるN -メチル- N個の -nitrosoureaを使用して視覚機能への影響の定量化を実証する。視力の喪失や減少感光番号が内顆粒層での増殖が行われました。完全な形態学的および機能的な再生は、30日、最初の治療後に発生した。
Abstract
産業界における失明の大部分を光受容体の損傷アカウントを生じたとの網膜変性疾患、 例えば網膜色素変性症、。動物モデルは、そのような疾患を研究するために極めて重要重要である。この点において、感光体特異的毒素N -メチル- Nの -nitrosourea（MNU）が広く薬理学的に網膜変性を誘導するために、齧歯類において使用されてきた。以前は、私たちはゼブラフィッシュにおけるMNU誘発性網膜変性モデル、視覚的な研究の別の人気モデルシステムを構築しています。
哺乳動物への魅力的な違いは、大人のゼブラフィッシュの網膜の損傷後の再生に永続的な神経発生である。この観察を定量化するために、私たちは、大人のゼブラフィッシュで視力測定を採用している。これにより、視運動反射は、非麻酔下の魚における機能変化を追跡するために使用された。これは、組織学ならびに免疫組織化学的stainiを補充した開発形態変化を相関させるためにアポトーシス（TUNEL）および増殖（PCNA）のためにngの。
要約すると、光受容体のアポトーシスが三日外顆粒層（ONL）における細胞の顕著な減少が続いているMNU処理、後に発生します。その後、内顆粒層（INL）及びONLにおける細胞の増殖が観察される。ここで、私たちは完全な組織学的だけでなく、機能的な再生だけでなく、30日の時間経過にわたって生じることを明らかにした。今、私たちは、ビデオ形式でMNUを使用して、ゼブラフィッシュの網膜変性および再生を定量化し、フォローアップする方法を示している。
Introduction
ビジョンは、人間のための最も本質的な意味であり、その障害は、高社会経済的影響力を持っています。先進国では、網膜変性疾患は、高齢者1の間で失明や失明の主な原因である。ほとんどの退行性網膜疾患の原因は部分的にしか理解されており、治療のソリューションは、失われた視力を回復することは非常に限られています。網膜色素変性症は、一次光受容体の損失2-3で網膜変性疾患の代表例である。N -メチル- Nの -nitrosourea（MNU）は網膜変性を誘導するので、広く一次光受容体細胞死4で疾患をモデル化するために、齧歯類において使用される。これは、アルキル化剤であり、通常、露光5-7後数ヶ月現れる良性および悪性腫瘍をもたらす。また、短期間の観察期間内の特定の光受容体細胞死を引き起こす。これにより、網膜層の損失structu再度、重要な網膜の菲薄化は、濃度依存的に観察された。網膜グリア細胞が活性化されたが、網膜色素上皮（RPE）には変化は見られなかった。小胞体（ER）ストレス関連アポトーシス、網膜8にMNU作用の主要経路であると思われる。
私たちは最近、ゼブラフィッシュ9の光受容体の変性を誘導するために、化学モデルとしてMNUを導入しています。他の理由の中で、ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ） は、他の脊椎動物10のそれに、その視覚系の類似性の視覚の研究に重要になってきた。外側の網膜は、紫外線、短、中にピーク感度、および可視スペクトルの長波長と1桿体タイプで四つの異なるコーンタイプに分類することができ、光受容体が含まれています。内顆粒層（INL）は、バイポーラ、水平、およびアマクリン介在ニューロンの細胞体はWELとして、発見されたミュラーグリア細胞の細胞体としてlである。外網状層（OPL）は光受容体と網膜内層の間のシナプス接合レンズに最も近い細胞層に対し、視神経および視神経管を備えた長い軸索を形成する成分神経節細胞層（GC）であり、形成されている。神経節細胞、および内顆粒層における細胞間のシナプス結合は内網状層（IPL）11が形成されている。 RPEは神経感覚網膜の外側にあると長い頂端微絨毛12で光受容体外側セグメントを取り囲んでいる。さらに、ゼブラフィッシュは、高度に再生し、傷害、脳、網膜、脊髄、心臓、および他の組織13を再成長させることができる。網膜損傷が発生すると、ミュラー細胞であると考えられているINL中の細胞は、活性化され、各種の網膜細胞型に分化する可能性を有している。さらに、それらはまた、ONLに位置しているロッド前駆体を生成する。もうそう新しい細胞と大人のゼブラフィッシュの網膜を供給するス間は、毛様体辺縁帯です。このソースは連続的に成長しているゼブラフィッシュの眼14に桿体光受容体の一定の密度を達成するために必要とされる。
MNUモデルは、網膜組織のための単純かつ再現性の変性/再生のアプローチとして使用することができる。によるゼブラフィッシュにおける生物学的プロセスの特定の類似性およびヒトにおいてこれは、関連細胞死経路を識別するためにドアを開ける可能性があり、潜在的な神経保護薬をスクリーニングする。私たちのグループからの以前の研究に基づいて、私たちは今、実験室のビデオ9に従って機能的な変更を含む、網膜変性およびその結果としての再生のこのMNU誘発のゼブラフィッシュモデルの方法を示している。
Protocol
Representative Results
Discussion
以前は、私たちのグループは、ゼブラフィッシュのシステム9にげっ歯類から光受容体変性のMNUモデルを転送した。その後のイベントは、説明し、30日まで追跡した。この期間では、完全な網膜の形態学的変性と再生は、初期治療後に発生した。まず、組織学はそれに対応して8日目に最低で一日3から減少ロッド細胞数を明らかにし、TUNEL染色は、3日MNU処理後の桿体のアポトーシスを識…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Monika Kilchenmann, Federica Bisignani and Agathe Duda for their excellent technical assistance.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A6283 | |
| Ammonia | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 294993 | 0.80% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 05470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 45260 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | 100%, 96%, 70% |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | E10521 | Tricaine |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11012 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 320331 | 0.20% |
| In situ Cell Death Detection Kit | Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland | 11684795910 | TUNEL Kit |
| Mayer's hemalum solution | Merck, Darmstadt, Germany | 109249 | |
| Methylnitrosourea (MNU) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | N4766 | Toxic |
| OptoMotry | CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada | n.a. | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Proteinase K | Dako, Glostrup, Danmark | S3004 | |
| Rabbit anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA | sc-33756 | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| TrizmaÒ base | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | T1503 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain | University of Fribourg, Dept. of Biology | n.a. | Own fish facility |
References
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