In Vitro Síntese de ARNm de modificação para indução da expressão da proteína em células humanas

Summary

Neste artigo de vídeo, que descrevem a síntese in vitro do ARNm modificado para a indução da expressão da proteína nas células.

Abstract

O fornecimento exógeno de codificação de RNA mensageiro sintético (ARNm) para a indução da síntese de proteínas nas células desejadas tem um potencial enorme nos domínios da medicina regenerativa, biologia celular básico, tratamento de doenças, e reprogramação das células. Aqui, nós descrevemos um protocolo passo-a-passo para a geração de ARNm modificado com reduzido potencial imunológico activação e aumento da estabilidade, controlo de qualidade de ARNm produzido, a transfecção de células com o mRNA e verificação da expressão da proteína induzida por citometria de fluxo. Até 3 dias após a transfecção com um único mRNA eGFP, as células HEK293 transfectadas produzir eGFP. Neste artigo de vídeo, a síntese de mRNA eGFP é descrito como um exemplo. No entanto, o procedimento pode ser aplicado para a produção de outros ARNm desejados. Usando o mRNA sintético modificado, as células podem ser induzidas a expressar transitoriamente as proteínas desejadas, que normalmente não expressam.

Introduction

Nas células, a transcrição de ARN mensageiro (ARNm) e a tradução na sequência de ARNm em proteínas desejadas garantir o bom funcionamento das células. Doenças genéticas, hereditárias ou adquiridas pode levar à síntese de proteínas insuficiente e ineficiente e causar doenças graves. Assim, uma nova abordagem terapêutica para induzir a produção de proteínas defeituosas ou em falta é o fornecimento exógeno de ARNm sintético modificado em células, que codifica para a proteína desejada. Desse modo, as células são acionados para sintetizar proteínas funcionais, que normalmente não podem produzir ou, naturalmente, não precisa. Usando esta abordagem, as doenças genéticas pode ser corrigido por introdução do ARNm que codifica para a proteína defeituosa ou falta ^1. A terapia de mRNA também pode ser utilizada para a vacinação de sintetizar proteínas, antigénios que são expressos pelas células tumorais ou agentes patogénicos. Deste modo, o sistema imune do hospedeiro pode ser activado para eliminar de forma eficaz as células tumorais ou prevenir infeficções ^2,3. Além disso, nos últimos anos, o ARNm foi utilizado com sucesso para gerar células estaminais pluripotentes induzidas (IPSCs). Para este efeito, os fibroblastos foram transfectadas com os mRNAs para induzir a expressão de factores de reprogramação ^4-6 e de convertê-los em iPSCs com um enorme potencial em medicina regenerativa.

Anteriormente, o uso de ARNm convencional estava associada com a baixa estabilidade e forte imunogenicidade. Assim, aplicações clínicas de mRNAs convencionais foram limitados. No entanto, a substituição de citidina e uridina por 5-metilcitidina e pseudouridina dentro da molécula de ARNm por Kariko e colegas rendeu moléculas de mRNA estáveis ​​em fluidos biológicos e reduziu dramaticamente a activação imunitária ^7-10, que agora permite que a aplicabilidade clínica de mRNAs modificados.

Utilizando mRNAs modificados produzidos sinteticamente, transcritos de genes desejados podem ser temporariamente entregues in vivo ¹¹ou in vitro para induzir a expressão da proteína. O mRNA é traduzido introduzido sob condições fisiológicas pela máquina de tradução celular. Devido à falta de integração no genoma da célula hospedeira em comparação com vectores de terapia de genes virais, o risco de oncogénese é impedido ^12,13. Assim, a terapia usando mRNA sintético modificado vai ficar melhor aceitação clínica no futuro.

Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para a produção de ARNm modificado (Figura 1), a transfecção de células com o ARNm e a avaliação da expressão da proteína em células transfectadas.

Protocol

1. Aumento de plasmídeos contendo Obrigatório Codificação de DNA seqüências (CDS) Meio de pré-SOC morno, que está incluída no kit de transformação, para a temperatura ambiente e as placas de agar LB contendo 100 ug / ml de ampicilina a 37 ° C. Equilibrar o banho de água a 42 ° C. Descongelar um frasco de química componente E. coli em gelo. Adicionar 1-5 ul do plasmídeo (10 pg a 100 ng) contendo os CDS para dentro do frasco de componente quimicamente E. coli</em…

Representative Results

Usando um plasmídeo pcDNA 3.3 contendo CDS da eGFP, a síntese de mRNA eGFP foi estabelecida modificada (Figura 1). Após a amplificação por PCR de inserção e poli-T-cauda, ​​uma banda clara com um comprimento de, aproximadamente, 1.100 pb é detectado (Figura 2). Aumentando o tempo de FPI aumentou o rendimento de ARNm (Figura 3). Após o IVT, uma banda de ARNm clara com um comprimento de, aproximadamente, 1.100 pb foi detectado, o que corresponde ao compriment…

Discussion

A terapia de ARNm tem um tremendo potencial no campo da medicina regenerativa, tratamento de doenças e de vacinação. Neste vídeo, que demonstram a produção de um ARNm modificado estabilizado para a indução da expressão da proteína nas células. Usando este protocolo, outros ARNm desejados podem ser gerados. A síntese in vitro do ARNm modificado permite a transfecção de células com mRNAs desejadas para induzir a expressão de proteínas alvo. Deste modo, a proteína desejada é expressa transientem…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Cell culture
DMEM, high glucose	PAA	E15-009
FBS	Life Technologies	10500
Penicillin/Streptomycin	PAA	P11-010	100x
L-glutamine	PAA	M11-004	200 mM
DPBS without calcium and magnesium	PAA	E15-002
0.04% Trypsin / 0.03% EDTA	Promocell	C-41020
TNS	Promocell	C-41120	Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA
HEK-293 cells	ATCC	CRL-1573
Consumables
Tissue culture plates, 12-well	Corning	3512
Cell culture flask (75 cm2)	Corning	430641
DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes	Eppendorf	0030 121.589	Safe-Lock, Biopur
15 ml conical tubes	greiner bio-one	188271
PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips	Eppendorf	10 µl: 022491202,    100 µl: 022491237, 1000 µl: 022491253
Cryovial	greiner bio-one	122279-128	Cryo.s
14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture	BD Falcon	352059
Plasmid amplification and purification
pcDNA 3.3_eGFP Plasmid	Addgene	26822
One Shot Top10 chemically component Escherichia coli	Invitrogen	C4040-10
Sterile water (Ampuwa)	Fresenius Kabi	1636071
LB medium (Luria/Miller)	Carl Roth	X968.1	Dissolve 25 g l-1 in sterile water.
LB agar (Luria/Miller)	Carl Roth	X969.1	Dissolve 40 g l-1 in sterile water.
Ampicillin Ready Made Solution	Sigma Aldrich	A5354	100 mg/ml
Glycerol	Sigma Aldrich	G2025
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
mRNA production
HotStar HiFidelity Polymerase Kit	Qiagen	202602
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
MEGAscript T7 Kit	Life Technologies	AM1334
5-Methylcytidine-5´-triphosphate	Trilink	N1014	5-Methyl-CTP
Pseudouridine-5´-triphosphate	Trilink	N1019	Pseudo-UTP
3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5`)G RNA cap structure analog	New England Biolabs	S1411L
RiboLock RNase Inhibitor	Thermo Scientific	EO0381	40 U/µl
TURBO DNase	Life Technologies	AM1334	2 U/µl (from MEGAscript T7 Kit)
Antarctic phosphatase	New England Biolabs	MO289S
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
RNaseZap solution	Life Technologies	AM9780
Transfection
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668-019	Cationic lipid transfection reagent
Opti-MEM I Reduced Serum Media	Invitrogen	11058-021	Improved Minimal Essential Medium (MEM) with  reduced Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation
Gel electrophoresis
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Gelred Nucleic Acid Gel Stain	Biotium	41003	10,000x in water
peqGOLD Range Mix DNA-Ladder	Peqlab	25-2210
0.5-10 kb RNA Ladder	Invitrogen	15623-200
1x TBE buffer
Flow cytometry analyses
CellFIX (1x)	BD Biosciences	340181	10x concentrate
Primer for insert amplification and         poly (T) tail PCR
Forward Primer (HPLC-grade) 10 µM	Ella Biotech		5´-TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACG-3´
Reverse Primer (HPLC-grade) 10 µM	Ella Biotech		5´- T120-CTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA-3´
Equipment
Cell incubator	Binder		CO2 (5%) and O2 (20%)
CASY cell counter	Schärfe System
Sterile workbench	BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH
Bacterial incubator	Incutec
Water bath
ScanDrop spectrophotometer	Analytic Jena
PCR thermocycler	Eppendorf
Microcentrifuge	Eppendorf
Vortex	peqlab
Thermomixer	Eppendorf
Gel apparatus for electrophoresis	Bio-Rad
Gel documentation system	Bio-Rad
FACScan System	BD Biosciences
Fluorescence microscope	Nikon
Phase-contrast microscope	Zeiss