Экстракорпоральное синтеза модифицированных мРНК для индукции экспрессии белка в клетках человека
Summary
В этом видео статье мы описывают синтез в пробирке модифицированной мРНК для индукции экспрессии белка в клетках.
Abstract
Экзогенный доставка кодирования синтетических РНК (мРНК) для индукции синтеза белка в нужные ячейки имеет огромный потенциал в области регенеративной медицины, основной клеточной биологии, лечения заболеваний, и перепрограммирования клеток. Здесь мы опишем шаг за шагом протокола для генерации модифицированной мРНК с пониженным потенциалом иммунной активации и повышенной стабильности, контроля качества производимой мРНК, трансфекции клеток с мРНК и проверки экспрессии белка индуцированной цитометрическим. До 3-х дней после одного трансфекции EGFP мРНК, трансфицированные клетки НЕК293 производить EGFP. В этой статье видео, синтез мРНК EGFP описан в качестве примера. Тем не менее, эта процедура может быть применена для производства других желаемых мРНК. Использование синтетических модифицированный мРНК, клетки могут быть индуцированы к временно выразить желаемые белки, которые они обычно не экспрессируют.
Introduction
В клетках, транскрипция матричной РНК (мРНК) и следующие перевод мРНК в нужных белков обеспечения надлежащего функционирования клеток. Наследственные или приобретенные генетические нарушения могут привести к недостаточной и неблагополучной синтеза белков и вызвать серьезные заболевания. Таким образом, новый терапевтический подход, чтобы вызвать выработку недостающих или поврежденных белков является экзогенный поставка синтетических изменены мРНК в клетках, который кодирует нужного белка. Таким образом, клетки активируются синтезировать функциональных белков, которые они обычно не могут производить или, естественно, не нужно. Используя этот подход, генетические нарушения могут быть исправлены путем введения мРНК, которая кодирует дефектных или отсутствующих белка 1. МРНК терапия также может быть использован для вакцинации, чтобы синтезировать белковые антигены, которые экспрессируются опухолевыми клетками или патогенов. Таким образом, хост иммунная система может быть активирована, чтобы эффективно устранить опухолевые клетки или предотвратить INFEctions 2,3. Кроме того, в последние годы, мРНК была успешно использована для генерации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). Для этой цели, фибробласты, трансфицированные мРНК, чтобы индуцировать экспрессию факторов перепрограммирования 4-6 и преобразовывать их в ИПСК с огромным потенциалом в регенеративной медицине.
Ранее использование обычного мРНК была связана с низкой стабильности и сильной иммуногенности. Таким образом, клиническое применение обычных мРНК были ограничены. Тем не менее, замена цитидином и уридином на 5-methylcytidine и псевдоуридина внутри молекулы мРНК по Kariko и коллег оказал молекулы мРНК стабильные в биологических жидкостях и резко снижается иммунная активация 7-10, который теперь позволяет клиническое применение модифицированных мРНК.
Использование синтетически произведенные модифицированных мРНК, желаемый ген стенограммы может быть временно поставлены в естественных условиях 11или в пробирке для индуцирования экспрессии белка. Введены мРНК переводится в физиологических условиях по переводческой техники сотовой. Из-за отсутствия интеграции в геном клетки-хозяина по сравнению с вирусными векторами генной терапии, риск онкогенеза предотвращается 12,13. Таким образом, терапия с использованием модифицированной синтетической мРНК получите лучшую клиническую принятие в будущем.
Здесь мы описываем подробный протокол для получения модифицированного мРНК (рис 1), трансфекции клеток с мРНК и оценки экспрессии белка в трансфекции клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
МРНК терапия обладает огромным потенциалом в области регенеративной медицины, лечения заболеваний и вакцинации. В этом видео мы покажем, производство стабилизированной, модифицированной мРНК для индукции экспрессии белка в клетках. Используя этот протокол, другие желаемые мРНК могу?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект был профинансирован европейских социальных фондов в земле Баден-Вюртемберг, Германия.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Cell culture | |||
| DMEM, high glucose | PAA | E15-009 | |
| FBS | Life Technologies | 10500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | 100x |
| L-glutamine | PAA | M11-004 | 200 mM |
| DPBS without calcium and magnesium | PAA | E15-002 | |
| 0.04% Trypsin / 0.03% EDTA | Promocell | C-41020 | |
| TNS | Promocell | C-41120 | Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Consumables | |||
| Tissue culture plates, 12-well | Corning | 3512 | |
| Cell culture flask (75 cm2) | Corning | 430641 | |
| DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 121.589 | Safe-Lock, Biopur |
| 15 ml conical tubes | greiner bio-one | 188271 | |
| PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips | Eppendorf | 10 µl: 022491202, 100 µl: 022491237, 1000 µl: 022491253 | |
| Cryovial | greiner bio-one | 122279-128 | Cryo.s |
| 14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture | BD Falcon | 352059 | |
| Plasmid amplification and purification | |||
| pcDNA 3.3_eGFP Plasmid | Addgene | 26822 | |
| One Shot Top10 chemically component Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
| Sterile water (Ampuwa) | Fresenius Kabi | 1636071 | |
| LB medium (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | Dissolve 25 g l-1 in sterile water. |
| LB agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | Dissolve 40 g l-1 in sterile water. |
| Ampicillin Ready Made Solution | Sigma Aldrich | A5354 | 100 mg/ml |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G2025 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| mRNA production | |||
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| MEGAscript T7 Kit | Life Technologies | AM1334 | |
| 5-Methylcytidine-5´-triphosphate | Trilink | N1014 | 5-Methyl-CTP |
| Pseudouridine-5´-triphosphate | Trilink | N1019 | Pseudo-UTP |
| 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5`)G RNA cap structure analog | New England Biolabs | S1411L | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 U/µl |
| TURBO DNase | Life Technologies | AM1334 | 2 U/µl (from MEGAscript T7 Kit) |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | MO289S | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNaseZap solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Transfection | |||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Cationic lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Invitrogen | 11058-021 | Improved Minimal Essential Medium (MEM) with reduced Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation |
| Gel electrophoresis | |||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Gelred Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | 10,000x in water |
| peqGOLD Range Mix DNA-Ladder | Peqlab | 25-2210 | |
| 0.5-10 kb RNA Ladder | Invitrogen | 15623-200 | |
| 1x TBE buffer | |||
| Flow cytometry analyses | |||
| CellFIX (1x) | BD Biosciences | 340181 | 10x concentrate |
| Primer for insert amplification and poly (T) tail PCR | |||
| Forward Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´-TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACG-3´ | |
| Reverse Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´- T120-CTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA-3´ | |
| Equipment | |||
| Cell incubator | Binder | CO2 (5%) and O2 (20%) | |
| CASY cell counter | Schärfe System | ||
| Sterile workbench | BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH | ||
| Bacterial incubator | Incutec | ||
| Water bath | |||
| ScanDrop spectrophotometer | Analytic Jena | ||
| PCR thermocycler | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Vortex | peqlab | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Gel apparatus for electrophoresis | Bio-Rad | ||
| Gel documentation system | Bio-Rad | ||
| FACScan System | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Phase-contrast microscope | Zeiss |
Referências
- Bangel-Ruland, N., et al. CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis "gene therapy". The journal of gene medicine. , (2013).
- Benteyn, D., et al. Design of an Optimized Wilms" Tumor 1 (WT1) mRNA Construct for Enhanced WT1 Expression and Improved Immunogenicity In Vitro and In Vivo. Molecular therapy Nucleic acids. 2, 134 (2013).
- Petsch, B., et al. Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection. Nature. 30, 1210-1216 (2012).
- Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature protocols. 8, 568-582 (2013).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell stem cell. 7, 618-630 (2010).
- Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors. Biochemical and biophysical research communications. 394, 189-193 (2010).
- Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic acids research. 38, 5884-5892 (2010).
- Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23, 165-175 (2005).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1833-1840 (2008).
- Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current opinion in drug discovery & development. 10, 523-532 (2007).
- Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature biotechnology. 29, 154-157 (2011).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. The Journal of clinical investigation. 118, 3132-3142 (2008).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. The New England journal of medicine. 363, 355-364 (2010).
- Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of biological engineering. 8, 8 (2014).
