Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Yayılması Published: September 25, 2014 doi: 10.3791/51953
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biology, University of Texas at Tyler, 2U. S. Horticultural Research Laboratory, USDA ARS

Summary

Burada in vitro Homalodisca vitripennis hücreleri ve HoCV-1 yaymak için bir protokol mevcut. Orta HoCV-1 pozitif kültürlerden çıkarıldı ve RNA 168 saat süre ile, her 24 saat ekstre edilmiştir. Hücre yaşayabilirliği tripan mavi ile nicelendirildi. Tüm virüs parçacıkları sonrası enfeksiyon ekstre edildi. Çıkarılan RNA QRT-PCR ile belirlenmiştir.

Abstract

Camsı kanatlı keskin nişancı (Homalodisca vitripennis) güneybatı Amerika Birleşik Devletleri boyunca bulunan bir çok vagile ve polifag böcek türüdür. Bu böcekler Xylella fastidiosa (X. fastidiosa) baskın vektörleri, asmanın Pierce hastalığı (PH) nedensel ajan bir ksilem sınırlı bakteri vardır. Pierce'ın hastalığı ekonomik zarar olduğunu; Bu şekilde, H vitripennis patojen yönetimi stratejileri için bir hedef haline gelmiştir. Homalodisca coagulata virüs-01 (HoCV-01) olarak tanımlanan bir dicistrovirus H. mortalite artışı ile ilişkili olduğu vitripennis popülasyonları. Bir konakçı hücre HoCV-01 replikasyonu için gerekli olduğundan, hücre kültürü lojistik ve biyolojik böcek öldürücü soyu üretimi için ekonomik açıdan önemli olan çoğaltma hedef için tek tip bir ortam sağlar. Bu çalışmada, H. büyük ölçekli üretimi için bir sistemde Doku kültürü ile vitripennis hücreleri geliştirildi, sViral replikasyon mekanizması roviding. HoCV-01 tüm vücut böceklerden çıkarılabilir ve kültür H'yi inoküle etmek için kullanıldı çeşitli seviyelerde vitripennis hücreleri. Kültür ortamı 168 saat, RNA ekstre edilmiş ve QRT-PCR ile analiz için her 24 saatte uzaklaştırılmıştır. Hücreler, tripan mavisi ile boyandı ve ışık mikroskopisi kullanılarak hücre hayatta kalma ölçmek için sayıldı. Tüm virüs parçacıkların toplam hücre kültürü çöküşü oluşmadan önce olduğu tespit edilen bir zaman noktasında olduğu enfeksiyondan sonra 96 ​​saat, kadar ekstre edilmiştir. Hücreler aynı zamanda floresan boyama tabi ve F-aktin bağlanma ve çekirdekler bütünlüğü viral aktivitesini araştırmak için konfokal mikroskopi kullanılarak incelendi. Bu çalışmanın sonuç olduğunu H. vitripennis hücreleri kültive edilip, bir biyolojik zararlı öldürücünün üretimine olanak sağlamak üzere müsait bir seviyede HoCV-01 kitle üretimi için kullanılan olma yeteneğine sahiptirler.

Introduction

Camsı kanatlı keskin nişancı (Homalodisca vitripennis Germar 1821), Kuzey Amerika'da 1, Xylella fastidiosa (X fastidiosa) baskın bir vektör olarak asma (PD) Pierce hastalığının nedensel ajanı tespit edilmiştir. Böcek nüfus yönetim hızla Kaliforniya ve güney Amerika Birleşik Devletleri genelinde bağcılık sektöründe bu yıkıcı sorunla mücadele için araştırma odağı haline gelmiştir. Familyasına ait olan bir pozitif sens, tek iplikçikli bir RNA virüsü Dicistroviridae, Homalodisca coagulata virüs 01 (HoCV-01), vahşi H. saptanmıştır vitripennis popülasyonları ve böcek için böceğin direncini düşürürken, bu toplumlarda 2-4 ölümleri arttırdığı gösterilmiştir.

Yöntemlerin geliştirilmesi etkili arka H. enfekte etmek Bir laboratuar ortamında yetişkinliğe vitripennis çünkü zor olmuştur 5-8 çeşitli gerektiren farklı sahne özgü beslenme ihtiyaçları var. Belirli tesisleri arka canlı H. gerekmektedir Amerika Birleşik Devletleri vitripennis; Bu nedenle hücre kültürü daha ekonomik ve etkili bir alternatif, hem de HoCV-01 tespiti ve çoğaltılması 2,9 giderek önem taşımaktadır. H. hücre kültürlerinin kurulması için temel yöntem ise vitripennis, virüsler 2 gibi, bu yöntemler, yine biyolojik kontrol maddelerinin ticari üretimi için normal olarak kullanılmamış olan, tarif edilmektedir.

Aşağıdaki prosedürler genel amacı, biyolojik kontrol maddesi olarak kullanım için müsait HoCV-01 gibi yüksek bir konsantrasyonunun üretmektir. Viral replikasyon neden başarılı H. yetiştirilmesi ve optimize bir canlı hücre gerektirir vitripennis kültürler virüs karlı seviyelerini üretme ilerleme için hayati önem taşımaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hücre Kültürü

Not: USDA Agricultural Research Service (ft. Pierce, FL ABD) Dr Wayne Hunter laboratuvar tarafından Homalodisca vitripennis hücre çizgileri, ilk ve fibroblast hücre mono tabakaları içeren karışık aşamadan oluşan bir laboratuar stok başlatmak için kullanılmıştır.

  1. 25 cm2, kültür şişelerinden ile 20-24 ° C'lik bir sıcaklık aralığında muhafaza steril bir laboratuar ortamında, aşağıdaki işlemleri gerçekleştirmek.
  2. Yetiştirmek ve H2G + yaprak piresi ortamı, bir tadil edilmiş WH2 bal ortam 10 (Tablo 1) ile 25 cm2 doku kültürü şişeleri içinde kültürleri korumak.
  3. 53 nem oranı% ~ 24 ° C 'de kültür şişeleri inkübe edin.
  4. , Herhangi bir anormal hücre büyümesi kontrol, örneğin kültür büyümesini izlemek, herhangi bir potansiyel kirletici için monitör ve kültürleriyle arasında büyüme ilerlemeyi kontrol etmek için toplam büyütme 100X (TM) bir ters mikroskop kullanınTure yüzey.
  5. Kültür yüzeyini bozmadan 10 gün - her 7 tam orta değişikliği (şişesi ortalama ~ 4 ml kültür ortamı) gerçekleştirin.
  6. Kültür yüzey hücreleri ayırmak etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ihtiva eden,% 0.25 tripsin kullanılarak hücre büyümesi (konfluent) kapsamındaki yaklaşık% 80 olduğu zaman kültür geçirin. Her kültür şişesine tripsin 3 ml ve kısa bir süre için enzime kültür (ler) maruz - ~ 2 Ekle - tam hücre ayrışmasını sağlamak için (5 10 dk).
  7. Enzim aktivitesini durdurmak için santrifüj ve konik tüp bütün çözüm aktarmak için - kültür şişesine (lar) (3 mi ~ 2) taze ortamın eşit miktarda ekleyin.
  8. 350 x g hızında 6 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj ile pelet hücreleri.
  9. Hücre topaklarını bozmadan Süpernatantı ve her bir tüpe ~ taze ortam 8 ml ekleyin. Yavaşça bir pipet kullanarak hücreleri homojenize.
  10. 1 Split kültürler: 2 oranı için 25 cm 2 şişeler (~ hücre soluti 4 mlkap başına üzerinde) ve ayrılmak taze kültür geçirilen süspansiyon halindeki hücreler şişenin yüzeyine sağlam bir şekilde tutunmasını sağlayacak, 48 saat boyunca rahatsız.
    Not: 1 cm2 'lik bir büyüme yüzeyi ile 48-çukurlu steril doku kültürü plakaları içindeki hücrelerin yetiştirilmesi mümkündür ve ~ 250 ul kültür ortamı hacimde bir azalma ile birlikte kültür şişelerinde aynı şekilde elde edilebilir.

2. Tüm virüs Ekstraksiyon

  1. Virüs pozitif H. tüm organları homojenize ~ 10 saniye aralıklarla girdap% 0.02 sodyum dietilditiyokarbamat trihidrat (DETCA) ile fosfat tamponu içinde vitripennis, pH-7.2, mevcut bir dokusunun daha büyük topaklar kalmayana kadar. 4 ° C de 4 saat ya da 4 ° C 'de 16 saat süre ile 22.000 x g boyunca 124.500 x g'de santrifüj ile SuperSpeed ​​virüs ekstrakte edin. Üstünde bir çökelti ortaya çıkarsa, steril pamuklu çubuk 11 ile çıkarın.
  2. Süpernatant atın.
  3. Pelet toplayın ve% 0.4 Na-deoksikolik asit ve% 4 polietilen glikol heksadesil eter (Brij 52) ihtiva eden, 5 mi 10 mM fosfat tampon maddesi (yok DETCA), pH değeri, 7.2 ile çözülür.
    1. De pelet karıştırmak için, tüpün yanından pelet kaldırmak ve gerekirse çözelti içinde kadar ezmek.
    2. Topak gerekirse çözelti haline ve 2 tüpler 11 birleştirmek yardımcı olmak için ~ 5 mi artışlarla daha 10 mM fosfat tamponu ilave edin.
  4. 15 dakika için 11 300 x g'de çözümü santrifüj.
  5. Süpernatantı ve bir 0.45 um filtre içinden çözeltisinin, ve büyük bir toplama tüpü 11 Süzüntüyü toplamak.
  6. Bir moleküler ağırlığa sahip bir diyaliz zarı transfer süzülen madde 10 mM'lik 11 gerekirse herhangi bir DETCA ihtiva eden fosfat tamponu (pH 7), küçük miktarları kullanılarak, 3.5 kD (MWCO) kesilir.
  7. 4 ° C'de GKD 2 O dolu olan büyük bir beher içinde diyaliz membranı yerleştirin. GKD 2 O her saat f değiştirinveya 5-6 saat sonra, zar 11, beyaz bir çökelti oluşana kadar.
  8. Zarı içinde saflaştırılmış virüsü toplamak ve GKD 2 O 90 ul solüsyon 10 ul ekleyerek 10-kat seyreltme serisi için% 100 virüs çözeltinin çok 100.000: Daha sonra 1 bir seyreltme ulaşana kadar GKD 2 O başka bir 90 ul seyreltme 10 ul ekleyin.
  9. -80 ° C'de saklayın virüs çözümü.

3. Viral kopyalama

  1. Hücre büyümesi (hücreler ortalama bir oranda artmaktadır, yaklaşık olarak 72 saat post-geçiş)% 80 birleşmeye kadar 48 oyuklu kültür plakaları içinde tohum hücreleri ve tüm satırları büyür.
  2. Hücre büyümesi konfluansa ulaştığında, seri halinde seyreltilmiş virüs, hücrelerin her satır inoküle, yani, 1:10 seyreltme, bir satır, bir 1 bir sıra: en üst sırasının dışında 100 seyreltme, vb. Bir kontrol olarak üst satırı kullanın ve ses kontrolü olarak her kuyuya GKD 2 O 10 ul ekleyin.
    1. Önce virüs kültürlerde herhangi bir kuyu İlk aşıdan her satırın ilk kuyu, deneysel hücre sayımları ile karşılaştırma için bir başlangıç ​​bazal hücre konsantrasyonunu kurmak ayırmak ve saymak için.
  3. Kültür plakaları, pH değişikliği gösteren bir ortam içinde herhangi bir renk değişikliği ve hücre morfolojisinde herhangi bir değişiklik için virüs aşılanmasından sonra her 24 saat izleyin.
  4. 100X TM bir ters mikroskop kullanılarak her bir zaman noktasında test plakası, görüntü bir sütun.
  5. Her bir 24 saatlik zaman noktasında görüntülenmiştir kolondan tüm Ortamı çıkarın ve -80 ° C de, viral RNA çıkartması ve miktar tayini ya da uzun bir dönem için -20 ° C 'de kısa süreli saklayın.
  6. Hücre Pelle yeniden suspande edilmesi için enzim aktivitesi ve taze ortam ~ 250 ul durdurma% 0.25 tripsin EDTA ve taze ortam arasında sadece yaklaşık 250 ul kullanılarak 1.9 - 1.6 aşamalarında daha önce tarif edildiği gibi orta çıkardıktan sonra kuyulardan hücreleri ayırmakt.
  7. Bir hafta boyunca her 24 saatlik bir süre boyunca hücre ayrılma sonra hücre sayıları gerçekleştirmek için hücreleri ihtiva eden her tüpe% 0.4 tripan mavi boyası, 10 ul ekle. Leke hücre sayımları yapmadan önce 10 dakika dinlendirin.
    1. Leke hem de cansız hücreler alımı başlar leke maruz bırakılarak ya da yaşayan hücrelerin, 1 saat içinde hücre sayar.
  8. Yavaş yavaş bir mikropipet kullanılarak standart bir hemasitometre her iki tarafına da lekeli hücre çözeltisinin 10 ul ekle. Veren çözelti, hava kabarcıklarını önlemek için kılcal hareketi ile yukarı alınır.
  9. Hemasitometre her iki tarafına uygulanabilir (non-lekeli) hücrelerin sayısını (hemositometrede 16 kareler 4 sayımları eşdeğer) sayılır. Çıkarıldı kolonun her bir oyuk için hücre sayar.
  10. Her kolondan hücre sayıları ortalama ve toplam hücre sayısı numarasını edinmek için aşağıdaki formülü kullanın: x seyreltme faktörü (hücre / 4 ortalama sayısı) = hücrelerin x 10 sayısını

Hücre Kültürü 4. Virüs Ekstraksiyon

  1. Tedavi H. Kaldır Enzim aktivitesini durdurmak için% 0.25 tripsin EDTA ve taze ortam arasında sadece yaklaşık 250 ul kullanılarak 1.8 - Kültür şişelerinden alınan hücreler, vitripennis aşamalarında daha önce tarif edildiği gibi 1.6.
  2. Süpernatant atın.
  3. 2.8 - 2.3 'te, daha önce adımda tanımlanan protokol ile kültür hücrelerinden ekstrakte virüs.

5. RNA Ekstraksiyon

  1. Üreticinin protokolüne göre, sıvı örnekleri için tasarlanmış bir guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu kullanılarak, her bir haftalık deneme sırasında toplanan virüs ortamı örnekleri RNA çıkarmak.
  2. -80 ° C'de saklayın numuneleri ekstre edilmiştir.

6. RT-PCR

  1. Kullanarak geleneksel PCR çalıştırarak RT-PCR için viral standartlar oluşturulmasıprimer çifti HoCV RT-PCR primeri 1 (ileri 5'-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 '-ACGACGGATCTGCGTGCCAA 5'-3, ters') virüsü ile tüm vücut H. izole vitripennis.
  2. Konu PCR ürünü,% 0.1 etidyum bromid içeren bir% 2 agaroz jeli içinde, 120 V, 60 dakika boyunca jel elektroforezi için.
  3. Jelden bantları pulu ve imalatçının protokolüne göre, bir jel ekstre etme kiti kullanılarak saflaştırılması.
  4. Havuz tüm kesilmiş ve jel ile saflaştırılmıştır ve ürün ayrıca temel etanol presipitasyonu ile saflaştırılması. Genel örnek konsantrasyonunu arttırmak Tris EDTA (TE) içinde yaklaşık 30 ul çökeltme ürünü elute edin.
  5. Nükleik asit saptama için 260/230 dalga boyu ayarlarını kullanarak spektrofotometre ile toplanmış örneklerin cDNA seviyesini ölçmek.
  6. 57 ng arasında değişen saflaştırılmış örnekteki bir on-kat daha seri seyreltme serileri sonuçları / 57 ug / ul (10 -18) ul. Benzer seri seyreltme i Me tarif edilen gerçekleştirmen konsantrasyon gereksinimleri farkı için yapılan ayarlamalar 2.8.
  7. Düşük yoğunluklu transkriptlerin güvenilir bir ölçümü QRT-PCR kiti kullanılarak QRT-PCR gerçekleştirilerek seyreltme serisinin tespiti sınırlarını belirler.
    NOT: 5 x 10 -3 kopya daha Viral konsantrasyonları daha düşük tespit değildir.
  8. Adım 5.1 'de daha önce tarif edildiği gibi deneysel numunelerin RNA ekstrakte ve spektrofotometrisi kullanılarak miktarı belirlenir.
  9. Nükleaz ücretsiz su kullanarak ul / 5 ng tüm ayıklanır örnekleri normalleştirmek.
  10. Aşağıdaki gibi 25 ul reaksiyonu, düşük kopya sayısını algılamak için yeteneğine sahip tek aşamalı bir QRT-PCR kiti kullanılarak olarak, iki kopya halinde, tüm numunelerde QRT-PCR uygulaması: 50 ° C'de 10 dakika boyunca tutun; 5 dakika boyunca 95 ° C'de tutma; 10 saniye, 30 saniye için 60 ° C 95 ° C 30 döngü; Her adımda 5 saniye 99 ° C - 50 eritebilir.
    1. Her bir reaksiyon karışımı, 1 x ustalar 12.5 ul içerir, böylece ana karışımı yapmakR karışımı, ileri primerin 1.0 ul (0.3 uM), ters primer, 1.0 ul (0.3 uM), ters transkriptaz ve standardizasyon değerlerine göre şablon değişken miktarlarda 0.25 ul.
    2. RNazsız su ile 25 ul toplam reaksiyon hacmi.
    3. Her bir PCR'nin beş standart konsantrasyonlar, aşağıdaki kopya numaralarıyla birlikte çalışmasını da kapsaması: 5 x 10 -10, 5 cm x 10 -8, 5 x 5 x 10 -4 -6 10, ve 5 x 10 -2 kopyalar. Her çalışma başında erken alımı sırasında gürültüyü azaltmak için, sadece 10x -2.5 bir floresan altına her çalıştırmak için eşik ayarlayın.

7. Konfokal Mikroskopi

  1. Her iyi çapı 18 mm boyutlarındaki on iki iyi plaka içeren cam lamelleri içinde Homalodisca vitripennis hücreleri büyümek.
  2. Bir tek-tabakalı elde edildiği zaman, dört günlük bir süre boyunca levha üzerinde her 24 saatte bir sütun inoküle. Her c emin olunolumn iyi bir denetimi içeren, düşük viral seyreltme (1:10) iyi ve yüksek viral seyreltme (1: 100,000) iyi. Adım 2.8 elde virüs çözümleri kullanın.
  3. Beşinci gününde tüm ortamları çıkarın ve iki kez 1x PBS (pH 7.4) ile hücreleri yıkayın.
  4. 30 dakika boyunca 4 ° C'de soğuk% 4 paraformaldehit ile hücreleri saptamak.
  5. 1x Fosfat 500 ul hücrelere serum fizyolojik (PBS) ilave edilmeden önce ilave edin ve düşük hızda bir sallama düzeneği üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yıkayın. Hücreleri üç kez yıkayın.
  6. Bunları permeabilize hücrelerin% 0.1 Triton X-100 500 ul ilave edin. Oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.
  7. Hücreler tekrar yıkama, daha önce tarif edildiği aşama 7.5.
  8. Oda sıcaklığında hücrelere engellemek için,% 5 sığır serumu albümini (BSA) çözeltisi 500 ul ilave edin. 2 saat boyunca oturup sonra çıkaralım.
  9. 1x PBS% 5 BSA içeren 250 ve F-aktin leke iyi her seyreltme 250 ul ekleyin: stok Rodamin kırmızı-konjuge Phalloidin (BİP) 1 seyreltin.
  10. Alüminyum f Kapak plakasıYağ ağartmadan boya önlenmesi ve 4 ° de CO / N inkübe hücreleri.
  11. 12 saat inkübasyondan sonra, RCP çıkarın ve hücrelerin çekirdekleri leke,% 5 BSA içeren PBS içinde 1x seyreltilmiş 6-diamidino-2-fenilindol 4 250 ul '(DAPI) (250 ug / ml) ile değiştirin .
  12. 1 saat boyunca oda sıcaklığında DAPI içeren hücreleri inkübe edin.
  13. Aşamasında önceden tarif edildiği gibi 7,5 1x PBS hücreleri üç kez yıkayın.
  14. Yavaşça kuyulardan lamelleri çıkarın ve bir anti-solmaya reaktif ile bir montaj medyayı kullanarak slaytlar mikroskop monte.
  15. Konfokal mikroskop altında inceledi kadar slaytlar kutulara lightproof kurumasını bekleyin. Boyalar hızla solmaya gibi gör kısa sürede hazırlanan slaytlar.
  16. 63X (yağ) Plan-apochromate lens içeren bir mikroskop ile donatılmış bir konfokal sistemi kullanılarak görüntü lekeli hücreler.
    1. 543 ± 10 nm uyarma ve Rhoadmine kırmızı-conjucated Phalloidin için 575 ± 10 nm emisyona lazer dalga boylarını ayarlamaDAPI'nin için, ve 369 ± 10 nm uyarma ve 450 ± 30 nm emisyon.
    2. Tüm görüntüler elde etmek için dedektör için aynı kazanç ve off-set ayarlarını kullanın.
    3. Görüntü işleme için uygun bir yazılım kullanarak bir görüntü yönetme yazılımı içine sıralama ve ithalat istenen görüntüleri Süreci görüntüler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hücre bağlanma ve büyüme primer kültürlerinde ve sürekli geçişlerinden, hem küçük hem de büyük bir kültür şişelerinde geçidinin 48 saat içinde görülmüştür. Fibroblast büyüme ve gelişme de bu süre içinde gözlenmiştir. Yeni seribaşı şişeler 48 saat önce rahatsız edildiğinde, orada, hücre eki görülür bir düşüş oldu, bazen yavaş büyüyen kültürlerde ve tüm hiçbir ek veya büyüme lider. Hücreler geçen bir hafta içinde, yaklaşık% 80 birleşmeye ve 10-14 gün (Şekil 1) bir tek tabaka oluşturulmuştur. Bu çalışmanın başlangıcında ekilmiş primer kültürler, herhangi bir morfolojik bozulma veya toplam hücre canlılığı düşüş olmadan 30 + hücre pasajları kalmıştır.

Hücre eki ve büyüme plakalarına matara geçişin 48 saat içinde görülmüştür. Bu daha küçük bir yüzey büyüme gibi tabakalı oluşumu, kısa bir zaman süresi içinde, yaklaşık 5-6 gün önce, elde edilmiştir. Enfekte kültürler fotoğraflandıt 100X ışık mikroskobunda azalan hücre şekil bütünlüğü belirtileri gösterdi. 48 saat sonrası enfeksiyon, büyük delikler hücrelerin yüzeyi üzerinde mevcut olan ne olduğu görülmektedir. Yaklaşık 72-96 saat sigara seyreltilmiş HoCV-01 (Şekil 2) ile enfekte edildikten sonra kültür şişelerinden karşısında, hücreler çekmiş ve kültür yüzeyinden müstakil.

Kontrolü için canlı hücre sayılarının ortalaması ve deneysel numuneler hesaplanır ve zamanla viral yük arasında canlı hücrelerin bolca farklılıkları (Şekil 3) tasvir çizildi. Kontrol grubu için, canlı hücrelerde tutarlı bir artış, sağlıklı hücrelere işaret bulunur. Nispeten tüm tedavi grupları, zaman içinde mevcut canlı hücre sayısında önemli bir azalma vardı. Daha düşük viral grupları yavaş yavaş 144 saat civarında bırakarak kadar azalmaya ise yüksek viral tedavi grupları, 48-72 saat arasında canlı hücrelerde büyük bir düşüş ile kültür sağlık çok daha belirgin bir düşüş göstermektedir. İki yönlü ANOVA wiTH Bonferroni post-hoc analizi, her zaman çalışma noktası, hem de gruplar arasında göre, her tedavi grubunda canlı hücre sayımı göre HoCV-01 hücre kültür ölüm oranları arasındaki farkı belirlemek için kullanıldı. Varyans iki yönlü analiz süresi kültürlerin uzunluğu tedavi etkilenen kültür uzun ömürlü maruz düşündüren, zaman faktörü, F (7, 432) = 82.5, p <0.0001 önemli bir etkiye sahip. Tedavi kültürleri alınan tipinin etkisi ilk olarak bir kültür alır viral yük miktarı, kültür hayatta kalmasını etkilediğini gösteren, hem de K (5, 432) = 170.6, p <0.0001 anlamlıdır. Zaman faktörü ve tedavi faktör arasındaki etkileşimde bir önemli etkisi, daha yüksek bir viral yük kültür uygunluğu azaltmak için gerekli daha kısa zaman miktarı ve tersine altını çizen, F (35, 432) = 17.63, p <0.0001 mevcutsa alt virüs yükü,Aynı etki için gereken daha uzun zaman süresi. Bonferroni post-hoc testler kayda değer bir doz yanıt belirten, tedavi ve kontrol grupları arasında anlamlı bir farklılık göstermektedir.

Ortalama canlı hücre sayımı analizleri alınan sonuçlara ilişkilendirerek, Kaplan-Meier eğrileri (Şekil 4) tarafından test gibi yüksek viral tedaviler ile aşılanmış hücrelerin yaşam olasılığı düşüktü. Kontrol veya enfekte edilmemiş hücreler için% 100 hayatta kalma oranı vardı. Daha düşük viral tedaviler 144 saat kadar hayatta kalma ihtimali daha yüksek olanlardır ise yüksek virüs muameleye maruz bırakılmış hücreler sonra hayatta kalma olasılığında bir azalma mevcut olduğu zaman içinde yaşam olasılığı önemli bir azalma vardı. Cox orantısal risk modeli analizi anlamlı değildi, tedavi Coeff = 0,8812 (% 95 CI [0.76, 1.02]), p> 0.05. Önemli olmasa da, veri virüse maruz kalmış hücreler, zaman içinde daha düşük yaşam oranları sergiledikleri% 88 daha fazla olduğunu göstermektedir.

Her Mah-PCR çalışması için, yüksek viral standartları daha önceki daha düşük viral standartlara ve deney örnekleri daha hızlandırıldığını. Her bir çalışma itibaren, Ct değerleri deneysel örneklerinde HoCV-01 RNA mevcut bolca farklılıkları test ve çoklu kontrol değerlerine değerleri karşılaştırmak için iki yönlü ANOVA kullanılarak analiz edildi çoğaltmak. Varyans, iki yönlü olarak anlamlı bir ana zaman faktörü etkisi, K (7, 289) = 0.38, p <0.05, ya da zaman ve tedavi grupları arasındaki etkileşim, K (63, 289) = 0.14 gösterdi, s > 0.05. Ilk olarak hücre kültürü tanıtıldı virüs bu miktarına işaret tedavi grupları, F (9, 289) = 135.7, p <0.0001, arasında Önemli bir etki gözlenmemiştir tespit viral RNA'nın miktarını etkiler. Bonferroni post-hoc testleri çalıştırmak ve tedavi gruplarında ve kontrol önlemlerinin, ancak tedavi g arasında anlamlı etkileşimler arasında önemli etkileşimler gösterir edildiherhangi bir ölçülebilir doz tepki yüzdesini gösteren, tek başına RUPLARI.

Sağlıklı hücre morfolojisi ve HoCV-01 farklar H. enfekte 24 ve 72 saat sonra hücreler, floresan altında vitripennis görüldü. Mevcut çekirdeklerin sayısı düşüş yanı sıra, kontrol ile karşılaştırıldığında, 01-HoCV maruz kalan hücrelerin F-aktin şekilsiz görünümü virüs kültürünün sağlığı üzerinde büyük bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. 01:10 viral yük yüksek maruz kalan hücreler, daha düşük viral tedaviye maruz kalan hücrelerin daha fazla sıkıntı göstermiştir. Kontrol hücreleri daha bol görünür ve iki kez puan (Şekil 5) arasındaki normal morfoloji var.

Grace Böcek ortamı (takviye, 1x) 210 mi
0.06 M L-histidin monohidrat bir çözelti (pH = 6,5) 290 mi
Orta 199 (10x) 10 mi
Orta 1066 (1x) 17 mi
Hank Dengeli Tuzları (1x) 33 mi
L-Glutamin (100x) 1.5 mi
MEM, amino asit karışımı (50x) 1.5 mi
1 M MCI çözeltisi 6 mi
Pen-strep (Glutamin / ağırlık) , 2.5 ml / 500 mi
Nystatin 1.0 ml / 500 mi
Gentamisin , 1.5 ml / 500 mi
Dekstroz 1.8 g
Fetal Sığır Serumu Nihai hacimde% 10

Tablo 1. H2G + yaprak piresi ortam bileşenleri.

Şekil 1
H. 1. Görüntüler Şekil vitripennis ce100X TM çekilen vitro ll büyüme. (A) Hücreler iki gün (48 saat) eki ve fibroblast gelişimini sergileyen sonrası geçit. Hücreler dört, altı, sekiz ve on gün kültür yüzeyde büyümeye devam post-geçit (BE). (F) Tek tabakalı oluşum meydana ~ 10- 14 gün. Ölçek çubukları:. 100 mikron bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2
Şekil 2. H. Enfekte 100X TM görüntülü vitripennis hücreler morfolojik değişiklikleri yakalamak. Inokülasyondan önce (A) Fibroblast büyüme. (B) Hücreler 24 saat Enfeksiyondan. (C) hücreler 48 saat sonrası enfeksiyon. (D) 96 saat sonra hücreler mesaja sahipçoğunlukla kültür yüzeyinden müstakil ve orta bulanık hale gelmiştir. Ölçek çubukları:. 100 mikron bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Viral yük deney süresince her gün için alınan ve standart sapma çubuklarla burada gösterilmektedir deneysel numuneler için ortalama canlı hücre sayımı Şekil 3. çubuk grafik. Canlı hücre sayılarının ortalaması deney örnekleri için hesaplanmıştır. Hücre sayıları. Düşük viral yük ile ~ 144 saat sonrası enfeksiyon canlı hücre sayıları yüksek viral yük ve önemli düşüşler canlı hücrelerde belirgin bir düşüş ~ 72 saat sonrası enfeksiyon göstermek ortalama LütfenBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 4
H. olmayan enfekte kontrole göre beş farklı HoCV-01 tedavilerin Şekil 4. Kaplan-Meier sağkalım analizi vitripennis hücre kültürleri. Kontrol kültürleri beş tedavi gruplarına göre% 100 hayatta kalma oranı muhafaza. Düşük sağkalım olasılığının yüksek tedavi grubunda görüldü ve tüm tedavi grupları, 168 saat, n = 10 sıfır yaşam olasılığı yöneleceği. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Figu. 24 saat aralıklarla 100,000 konsantrasyonlar: Homalodisca vitripennis hücreleri seri ile enfekte edilmiştir 5. Kontrol Konfokal görüntü ve enfekte edilmiş hücreler, yeniden H.vitripennis 1:10 ve 1 HoCV-01 seyreltilmiştir. Hücreler kültürlerin içinde F-aktin ve çekirdekleri görselleştirmek için rodamin Phalloidin ve DAPI lekeleri ile tedavi edildi. Konfokal görüntüleri 63x yakalanır ve düşük ve yüksek viral seyreltilerde hem de 72 saatte hücre morfolojisi bir mola aşağı göstermek edildi. Ölçek çubukları:. 1 mikron bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Istilacı tarımsal türlerin akını ilişkin artan endişeler gelişmekte olan zararlılara ve patojenlere karşı savunmak için yeni metodolojiler için artan bir talep yol var. Hastalık önleme ve yönetim odağı patojen vektörler yönetimini içerir ve bu çalışmanın birincil hedefi oldu. Ekonomi pratik uygulama büyük alanlar üzerinde ancak düşük bir maliyetle 12 de büyük miktarlarda olması gerekiyor, çünkü tarımda karantinası yönetmek için biyolojik zararlı öldürücünün bu tür üretmek için karar hayati bir rol oynamaktadır. Araştırma ve geliştirme için hücre kültürü kullanan uygulama giderek yaygın hale gelmiştir ve gibi, bu çalışmanın etkileri önemlidir. Ekonomik açıdan entegre zararlı yönetimi (IPM) stratejiler belirlenmesi, dünya çapında devam başarılı tarımsal üretim için anahtar ve bu çalışmada bulgular IPM stratejileri geliştirmek ve asma PD oluşumunu azaltmada ilerleme katkıda bulunur.

H. vitripennis hücre kültürleri yayılır ve herhangi bir görünür morfolojik bozulmadan Bir yıl boyunca muhafaza edildi. Passage numaraları ölçüde hücre metabolizmasını ve büyüme özellikleri 13 değiştirerek memeli hücrelerinde in vitro çalışmaların sonuçlarını etkileyebilir. Hücreleri in vivo ve in vitro çoğaltma gibi, telomer hücre replikasyon her turda ile kısaltmak ve sonunda çok kısa haline telomerlerin kritik sınırına ulaşmak için ve hücresel yaşlanmayı 14 neden. Şiddetli telomer kısalmasının oluştuğunda, genetik istikrarsızlık ve nihayet kriz veya büyük hücre ölümü 15 oluşur. Bu fenomenin, kültürleri nadiren 50 kültivasyon veya bir yıl ötesinde hayatta olduğundan, aşağıdaki ölçütlere göre, Hayflick Limiti sayılır: seks kromatin histotipik farklılaşma, inadaptability tutulmasını kültürü, habis olmayan in vivo özellikleri, yetiştirme sonlu sınırını askıyaBirincil dokusuna benzer hücre morfolojisi, hücre sıralarında, Coxsackie A9 reseptör maddenin tutulması ve incinmeler 16 geliştirilebilir hangi kolaylaştırmak kıyasla asit üretimi artmıştır. Pasaj numaralarının potansiyel komplikasyonları hücre hattı yayılım bu yöntem, uzun zaman süreleri boyunca sürekli üretim kapasitesine sahip olduğunu gösterir, bu çalışma süresince gözlenmedi. Canlı bir böcek yetiştirme veya diğer pahalı ve karmaşık üretim yöntemleri üzerinde hücre kültürü kullanımı hızla birçok disiplinlerde yaygın hale geliyor, çünkü hücre hattı bu tip uzun ömürlü birçok pratik uygulamalar vardır. Uygun bir şekilde muhafaza ise, tek bir ana hücre çizgisi virüs üretim sanmı için kullanılabilir.

Bu hücrelerin uzun süreli ve başarılı bakım iki önemli faktör taze ekilmiş kültürler ve uygun ortamı hazırlanması için rahatsızlık dönemdi. 4 İlk dokunulmadan kalmıştır KültürleriGeçişinden sonra 8 saat o ilk penceresi içinde hareket olduğunu kıyasla çapraz şişe büyümesinde belirgin bir artış göstermiştir. Rahatsız sol, hücrelerin hızlı çoğaltma kültür şişelerinde fazla on gün içinde tek-tabakalar geçit sonrası elde edildi. Orta hazırlık kadarıyla genel kültür sağlık söz konusu olduğunda rahatsızlık zamanı olarak çalışma sırasında hayati oldu. Hatta ortamda mevcut antibiyotiklerle, bakteriyel kontaminasyon hala orta hazırlanırken dikkate alınması gereken önemli bir faktör oldu. Bakteriyel kontaminasyon yaklaşık olmayan faktöre indirgenerek çünkü kültürlerde kullanılmadan önce birkaç gün oda sıcaklığında kalması için ortamdan örnekler sağlayarak, kültür yıkıcı bir dizi olasılığı düşer. Örneğin gentamisin ve streptomisin gibi antibiyotikler, yaygın hücreler ve herhangi bir dış kirlenmeye içinde bulunan bakterilerle mücadele için hücre kültür ortamı kullanılmıştır. Bu antibiyotiklerin her ikisi, memeli hücre kültüründe büyüme depresyon ile bağlantılı olan bir17,18 bakterilerin antibiyotiğe karşı dirençli suşlannın yakalanma olasılığını arttırmak için bir aseptik teknikler kullanılarak azalma ve endişe d. Antibiyotikler aşırı kullanılmamalıdır; Bununla birlikte, bunların kullanımı, hücre kültürü kirlenme sorunları önlemek için gereklidir.

Bu faktörlerin etkileri hücrelerinin yukarı ölçekleme üretim hücre kültürlerinin kalitesini sağlamak için küçük adımlarla biopesticide malzemelerin hızlı seri üretim için uygun bir seçenek olduğunu şekildedir. Biyoreaktörler 1950 ve 1960 yılında ortaya çıkan ve zaman 19 derece kısa miktarda hücreleri milyarlarca üreten verimli bir aracı temin etmek gelişti beri var. Biyoreaktörler birçok türleri önemli ölçüde bu H. sayısını artırmak için yararlanılabilir ana kadar vitripennis hücreleri bir kez üretilen ve üretim sistemi bu tür geliştirme süreci ileri geri kesme bilmek hücreleri tedavi etmek için bir yöntemin geliştirilmesine ihtiyaç vardırm büyüme biyoreaktörlerde yüzeyler.

Hücre hatlarının sürekli büyüme başarılı virüs kültürleri içinde kalmasına izin gereken vitro replikasyon ve ne kadar ölçülebilir için gerekli olan virüs ne kadar sorunu gidermek için kullanılabilir, HoCV-01 çoğaltma için çok önemlidir ve bir kez elde edilmektedir. Net bir korelasyon hücreleri tarafından alınan ilk viral yük miktarı ve zaman virüs parçacıklarının süresi ile saptanmıştır hücreleri içinde inkübasyona izin verildi. Bir hızlı virüs çoğalması gösteren hücre ölümü için zaman gereksinimi, daha düşük viral yük aldığı yüksek olur. Bununla birlikte, tüm tedavilerde hücre sayıları kapsayıcı bir hücre kültürü hayatta kalabilme eşiğini gösteren, yaklaşık 25 x 10 4 hücre / ml bir eşik değeri 144 saat sonrası enfeksiyon altına düşmüştür. Sonuçlar, virüsün daha fazla miktarda ilk enfeksiyonu için hazır olup olmadığını virüsün hızlı bir şekilde büyük miktarlarda üretilebilir olduğunu göstermektedir, ya da arttırdığınıVirüsün ased miktarları düşük bir başlangıç ​​dozu ile daha uzun bir süre boyunca elde edilebilir. Konsantrasyon ve zaman faktörleri arasındaki ilişkinin Değişkenlik 72-96 saat sonrası enfeksiyon optimal bir viral ekstraksiyon süresi daha büyük ölçekli çalışmalar için üretim seçeneklerine bazı esneklik sağlar.

Viral çalışmaları için hücre kültürleri, hedef virüs tespit edebilir ve çalışmanın sonuçlarını ölçmek için kabiliyetine bağlıdır. Bunun için güvenilir bir yöntem, deney numunesi içinde viral RNA dizilerinin varlığını kontrol etmek için PCR kullanmaktır. Bu çalışmada PCR verileri Ct değerlerinin analizi virüsün optimum ekstraksiyon zaman ne olacağını net bir cevap vermez; Ancak, kesin bir ekstraksiyon zaman eksikliği HoCV-01 in vitro çoğaltmak için bir yetersizlik göstergesi değildir, ancak viral çalışmaların hassas doğası. Mavilerin kullanılarak hücre sayımları optimum ekstraksiyon kez daha net bir görünüm ödünç ama hiçbir DEFINITIV sayesinde vardır yoke cevap. Hücre ölümü veriler çok 72 saat sonra hücre hayatta kalma azalma, yüksek viral yük, kültürdeki hücreleri ölür başladıkça, 48 saat ve 72 saat sonrası arasında enfeksiyon virüs özütleme viral partiküllerin hücresel dağılımını azaltmak için ideal olabilir belirten neden olduğunu göstermektedir katlanarak. Düşük başlangıç ​​viral yüklerinde Ekstraksiyon kat daha belirsiz, ama 144 saat sonra hücre beka dramatik düşüşler, optimal çıkarma zamanı 24 olacağı speküle edilebilir - o zaman noktaya öncesinde 48 saat. Optimal viral ekstraksiyon süresinin belirlenmesi H. karşı kullanılmak için Biopestisitlerin etkili üretimi için hayati önem taşımaktadır vitripennis enfestasyonlar ve bu çalışma o zamanlardan belirlenmesine yönelik önemli bir adım atmıştır.

Mikroskopi hücre kültürü analizi için önemli bir araçtır ve bu çalışma H. ile konfokal mikroskopi kullanmak için ilk biridir vitripennis hücreleri. Görüntüleme protein eki artış veya düşüş ve bolluğuhücre çekirdekleri in vitro HoCV-01 hücre içi faaliyet içine daha detaylı çalışmalar yolunda ilk adımdır. Bu çalışma boyunca, hücre kültürleri görünür hiçbir morfolojik bozulmalar ile muhafaza edildi. Her bir sonraki hücre geçtikten sonra, normal bir fibroblast büyüme tek tabaka oluşumu, ardından gözlemlenmiştir. Hücreler, şekil ve boyut olarak düzgün olursa. Enfekte olmuş kültürler konfokal mikroskobu ile görüntülenmiştir, ancak, hücre morfolojisi düşüşler, yüksek ve düşük bir başlangıç ​​viral yükü hem de, özellikle de 72 saat zaman noktasında gözlenmiştir. Küçük delikli benzeri yapıların muhtemelen hücre ölümü nedeniyle hücre içi ve hücre malzemenin çıkmasına yüzeyler üzerinde görülebilir. Şişe yüzey üzerinde hücreler buruşuk ve sonunda yüzeyden ayırmak başladı. Daha yüksek çözünürlük mikroskopi bu ilk kullanımından etkileri, hücre hayatta kalma analizinde görülen sonuçlara için bağ ve artmış viral çalışmalar için diğer olası kullanımları yol açar. Gelişmiş milHoCV-01 antikoru geliştirme yapılmıştır halinde croscopy teknikler maksimum yeteneklerine kullanılabilir. Virüsün antikorlar için viral partiküllerin içi çalışmalarının görüntülenmesini sağlayacak değil, aynı zamanda proliferasyon oranlarını tespit etmek ve daha da hassas bir kez ekstraksiyon yardımcı olabilir.

Büyük hücre biyokütleler virüs üretmek ve alanlarına uygulanır bir noktaya biyolojik kontrol maddesini üretmek için bu çalışmada geliştirilen üretim yöntemleri ölçekleme işlemi, çoğunlukla eksiksiz bir konudur. Büyük ölçekli sistemler kurma ilk maliyetleri yüksek ve birçok faktör gibi, dikkate alınması gereken adres: karlılık, hücre ve virüs verimlilik, hücre kültür ortamı maliyetleri, uygulama oranı, üretim ölçeğine ve toplu üretim maliyetleri 12. Başlangıç ​​maliyeti rağmen, potansiyel ödeme off yatırım değerdir. Dere arıtma sorunları aşağı, hücre kültürü teknikleri kullanılarak büyük ölçüde be azalırbağırsak mikrop ve tüm vücut böceğin içinde bulunan diğer virüslerin olasılığı büyük ölçüde canlı bir böcek bakım ve yetiştirme için tesis maliyetlerinin yanı sıra, azalır neden.

Zaten proteinler, Biopestisitlerin ve diğer ilaçların üretimi için kullanılmaktadır hücre kültürü, araştırma bu alan için ekonomik değeri artmaktadır. Tarımda biyopestisitlerin büyük ölçekli üretimi için, biri burada tamamlayan, fakat daha büyük hücre büyüme sistemi kullanarak benzer bir çalışma denemek için yararlı olacaktır. Biyoreaktörler ve 3D matris hücre büyüyen sistemlerinin yeni metodoloji aynı saygı büyük hacimli hücre üretimi ve viral üretim 20 büyük hacimler için izin verir. Büyük ölçekli sistemlerini oluşturmak için gerekli ilk maliyeti yüksek olsa da, üretilecek olan güçlü bir ürünün miktarı olarak ödeme daha büyük olma potansiyeline sahiptir. Büyük ölçüde, büyük ölçekli sistemler describ iletim çalışmaları sürdürmek için ödünç verirdim bir çalışma alanıed Yukarıda antikor tasarımıdır. Antikor tasarımı HoCV-01 için zaman alıcı ve ayrıntılı bir süreçtir iken konfokal mikroskobu ile in vitro viral aktivite görselleştirilmesi için izin verecek, HIV ve hepatit C gibi viral hastalıklar için artan çalışmalarda kullanılmıştır ve diğer yol açabilir soruşturma alanları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Corning cell culture flasks Sigma Aldrich CLS430168 Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 Olympus Inverted microscope and camera
Trypsin-EDTA solution Sigma Aldrich T4049 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates Sigma Aldrich M8937 48 wells (TC treated with lid)
DETCA Sigma Aldrich 228680 Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate
Corning bottle-top vacuum filter system Sigma Aldrich CLS431206 Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 ml
Brij 52 Sigma Aldrich 388831 Polyethylene glycol hexadecyl ether
Phosphate buffer solution Sigma Aldrich P5244 Received as 100 mM diluted to 10 mM with sterile water
TRIzol LS Life Technologies 10296-028
Agarose Sigma Aldrich A5304 For electrophoresis
Ethidium bromide Sigma Aldrich E7637 BioReagent, for molecular biology, powder
QIAquick Qiagen 28704
QuantiTect qRT-PCR kit Qiagen 204243
4% paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 Reagent grade, crystalline
PBS Sigma Aldrich P5368 Phosphate buffered saline
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153
Rhodamine red-conjugated phalloidin Life Technologies R415 Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine
DAPI Sigma Aldrich D9542
ProLong Gold Antifade Reagent Life Technologies P36934
LSM510 Meta Confocal System Carl Zeiss
LSM Zen 2007 Software Carl Zeiss
Grace’s Insect medium (supplemented, 1x) Sigma Aldrich G8142 H2G+ leafhopper medium component
L-histidine monohydrate Sigma Aldrich H8125 H2G+ leafhopper medium component
Medium 199 (10x) Sigma Aldrich M4530 H2G+ leafhopper medium component
Medium 1066 (1x) Sigma Aldrich C0422 H2G+ leafhopper medium component
Hank’s Balanced Salts (1x) Sigma Aldrich 51322C H2G+ leafhopper medium component
L-Glutamine (100x) Sigma Aldrich G3126 H2G+ leafhopper medium component
MEM, amino acid mix (50x) Sigma Aldrich 56419C H2G+ leafhopper medium component
1 M MgCl solution Sigma Aldrich M8266 H2G+ leafhopper medium component
Pen-Strep (w/ glutamine) Sigma Aldrich G6784 H2G+ leafhopper medium component
Nystatin Sigma Aldrich N6261 H2G+ leafhopper medium component
Gentamycin Sigma Aldrich 46305 H2G+ leafhopper medium component
Dextrose Sigma Aldrich D9434 H2G+ leafhopper medium component
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442 H2G+ leafhopper medium component

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).
  2. Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata. J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).
  3. Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae). Virology. 350 (1), 67-78 (2006).
  4. Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1). Virology. 153, 61-67 (2008).
  5. Jones, W. A., Setamou, M. Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea. Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).
  6. Turner, W. F., Pollard, H. N. Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease. US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).
  7. Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species. Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).
  8. Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers. Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).
  9. Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae). In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).
  10. Hunter, W. B. Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae). In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).
  11. Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. CA Pierce’s Disease Symposium, Sacramento, CA, , 9-12 (2009).
  12. Rhoades, D. J. Economics of baculovirus – insect cell production. Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).
  13. Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells. P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).
  14. Chin, L., et al. Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis. Cell. 97 (4), 527-538 (1999).
  15. Counter, C. M., et al. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).
  16. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).
  17. Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture. In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).
  18. Coriell, L. L. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. Contamination in Tissue Culture. Fogh, J. . , Academic Press. 29-49 (1973).
  19. Hambor, J. E. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).
  20. Abbot, A., Cyranoski, D. Biology’s new dimension. Nature. 424, 870-872 (2003).

Tags

Enfeksiyon Sayı 91, Hücre kültürü asma Pierce hastalığı,
Yayılması<em&gt; Homalodisca coagulata virüs 01</em&gt; Yoluyla<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Hücre Kültürü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Biesbrock, A. M., Powell, C. M.,… More

Biesbrock, A. M., Powell, C. M., Hunter, W. B., Bextine, B. R. Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture. J. Vis. Exp. (91), e51953, doi:10.3791/51953 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter