הקלטות תא כל לזווג בפרוסות בהיפוקמפוס Organotypic
Summary
Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.
Abstract
Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.
Introduction
קולטני גלוטמט לתווך רוב שידור סינפטי מעורר בסינפסות במערכת עצבים מרכזית. שני תתי הסוגים העיקריים של ionotropic קולטני גלוטמט המקומי בראש עמוד השדרה של קרום postsynaptic הם N-methyl-D-aspartate (NMDA) וα-אמינו-3-הידרוקסי-5-methylisoxazole-4-proprionic חומצת קולטנים (AMPA). בנחים פוטנציאלי קרום, קולטני AMPA לשאת רוב הנוכחי postsynaptic במהלך שידור סינפטי. בהיפוקמפוס, רצפטור NMDA ממלא תפקיד מרכזי בגרימת שינויים במספר הקולטנים AMPA בממברנה postsynaptic: על ידי מתנהג כמו "גלאי צירוף מקרים" 1 ליזום שינויים בכוח הסינפטי 1, רצפטור NMDA משתתף במנגנונים סינפטיים כי הם חשבו כדי לחזק את למידה וזיכרון ברמת subcellular. בתגובה לשלילת קוטביות של הנוירון postsynaptic במקביל לשחרור משדר presynaptic, סידן נכנס דרך NMDAקולט ליזום הכנסת קולטן AMPA או הסרת 2. דינמיקת קולט אלה עומדת בבסיס פלסטיות סינפסה: עלייה בכח הסינפטי היא 2,3 הגברה לטווח ארוך (LTP), ואילו ירידה בכוח הסינפטי היא דיכאון לטווח ארוך 4 (בע"מ). לכן הוא חשב תנועת קולטן AMPA שיהיה אחראי לביטוי פלסטיות הסינפטית, ואילו קולטני NMDA הם חשבו לשלוט האינדוקציה שלה.
קביעת המנגנון המדויק שבבסיס שידור סינפטי ופלסטיות דורשת לימוד אוכלוסיות קטנות של סינפסות, באופן אידיאלי סינפסות בודדות. בעוד כמה סינפסות הן מאוד מתאימות למחקר ברמה זו, למשל, Calyx של הלד 5, לאוכלוסיות הסינפטי ביותר זה קשה מאוד בשל האופי הקטן ומפוזר של הקשרים סינפטיים. שתי טכניקות עיקריות אלקטרופיזיולוגיה פותחו כדי לבחון קשרים סינפטיים אחת: הראשון הוא גירוי מינימאלי, wherדואר סיב אחד presynaptic הוא בחזקת מגורה extracellularly. הטכניקה השנייה היא זיווג הקלטות, שבו שתי הקלטות תא כל בו זמנית מתא העצב מחובר synaptically מתבצעת. יתרון עיקרי של גירוי מינימאלי הוא שזה מהיר ופשוט יחסית לביצוע, הכולל מיקום של האלקטרודה מגרה תאית לתוך מערכת axonal בעת הקלטה בו זמנית מתא עצב postsynaptic. הדאגה העיקרית בעת השימוש בטכניקה זו היא שגירוי אמין של תא בודד יכול לעתים רחוקות להיות מובטח משפט אחרי המשפט.
במהלך חמישה עשר השנים האחרונות יש לנו בשימוש שיגרתי לזווג כל תא הקלטות משני נוירונים פירמידה מחוברים synaptically 6-17. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי רק אחד נוירון presynaptic מגורה באופן עקבי ואמין. זה גם מאפשר לא רק אפיון אלקטרו אלא גם מניפולציה תרופתית של נוירון presynaptic 6,18 </ Sup>. עם זאת, ההסתברות של קישוריות הסינפטית בין תאי העצב היא נמוכה, מה שהופך את זוגות מחוברים קשה להשיג 19. השימוש בתרבויות פרוסה מוח organotypic עוקפת את המכשול הזה כקישוריות הסינפטית יכול להקים מחדש במבחנה ויותר מכך את טבעו של הקישוריות וכתוצאה מכך הוא דומה לזה ברקמת מוח ילידי 20. בנוסף, תרבויות organotypic להביע LTP, בע"מ 7-10,12-15,21 וצורות נוספות של פלסטיות הסינפטית לטווח קצר כולל הנחיית לזווג דופק (PPF) ודיכאון (PPD) 6,22,23, המאפשרים למנגנוני פלסטיות ל יילמד בזוגות של תאי עצב. כאן אנו מתארים את המתודולוגיה מפורטת הכרוכה בהשגת הצלחת הקלטות לזווג במערכת זו במבחנה. מידע זה בקלות יכול להיות מותאם למערכות ניסיוניות אחרות, כוללים פרוסות חריפות ואזורים אחרים במוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן יש לנו תיארנו את הדרישות להקמת הקלטות תא מוצלחות לזווג כל בתרבויות פרוסה בהיפוקמפוס organotypic. יכולות גם להתבצע הקלטות מותאמים בהכנות מרובות, כוללים פרוסות חריפות ומערכות תרבות ניתקו 26,27. למרות ההתמקדות כאן הייתה על הגיוס של צורות ארוכות יותר של פלסטיות הסינפ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the members of the Montgomery and Madison labs for helpful discussion. We acknowledge the funding received from the following sources in this research: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC, and NIH.
Materials
| Organotypic cultures | Paired recordings | ||
| Minimum Essential Medium | Stable motorized micromanipulators | ||
| Penicillin-Streptomycin solution | Shallow tissue bath | ||
| HEPES buffer solution | DIC camera | ||
| 1M Tris stock solution | Amplifier | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Computer | ||
| Horse Serum | Vibration isolation table | ||
| plastic-coated miniature spatulas | Upright microscope | ||
| soft paintbrush | Data acquistion and analysis software | ||
| manual tissue chopper | Electrode puller | ||
| #2 filter paper | Faraday cage | ||
| #5 forceps | |||
| Membrane inserts | |||
| CO2 incubator | |||
| Dissection hood | |||
| Class II hood |
Referências
- Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S. F. The glutamate receptor ion channels. Pharmacology Reviews. 51, 7-61 (1999).
- Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Long-term potentiation – A decade of progress. Science. 285, 1870-1874 (1999).
- Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. Journal of Physiology. 232, 331-356 (1973).
- Dudek, S. M., Bear, M. F. Homosynaptic long-term depression in area CA1 of hippocampus and effects of N-methyl-D-aspartate receptor blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 89, 4363-4367 (1992).
- Borst, J. G., Soria van Hoeve, J. The calyx of held synapse: from model synapse to auditory relay. Annual Reviews in Physiology. 74, 199-224 (2012).
- Pavlidis, P., Madison, D. V. Synaptic transmission in pair recordings from CA3 pyramidal cells in organotypic culture. Journal of Neurophysiology. 81, 2787-2797 (1999).
- Pavlidis, P., Montgomery, J. M., Madison, D. V. Presynaptic protein kinase activity supports long-term potentiation at synapses between individual hippocampal neurons. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4497-4505 (2000).
- Montgomery, J. M., Pavlidis, P., Madison, D. V. Pair recordings reveal all-silent synaptic connections and the postsynaptic expression of long-term potentiation. Neuron. 29, 691-701 (2001).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. State-dependent heterogeneity in synaptic depression between pyramidal cell pairs. Neuron. 33, 765-777 (2002).
- Montgomery, J. M., Selcher, J. C., Hansen, J. E., Madison, D. V. Dynamin-dependent NMDAR endocytosis during LTD and its dependence on synaptic state. BMC Neuroscience. 6, 48 (2005).
- Waites, C. L., et al. Synaptic SAP97 isoforms regulate AMPA receptor dynamics and access to presynaptic glutamate. Journal of Neuroscience. 29 (14), 4332-4345 (2009).
- Emond, M., et al. AMPA receptor subunits define properties of state-dependent synaptic plasticity. Journal of Physiology. 588, 1929-1946 (2010).
- Li, D., et al. SAP97 directs NMDA receptor spine targeting and synaptic plasticity. Journal of Physiology. 589, 4491-4510 (2011).
- Genoux, D., Bezerra, P., Montgomery, J. M. Intra-spaced stimulation and protein phosphatase 1 dictate the direction of synaptic plasticity. European Journal of Neuroscience. 33 (10), 1761-1770 (2011).
- Selcher, J. C., Xu, W., Hanson, J. E., Malenka, R. C., Madison, D. V. Glutamate receptor subunit GluA1 is necessary for long-term potentiation and synapse unsilencing, but not long-term depression in mouse hippocampus. Brain Research. 1435, 8-14 (2012).
- Arons, M. H., et al. Autism-associated mutations in ProSAP2/Shank3 impair synaptic transmission and neurexin-neuroligin-mediated transsynaptic signaling. Journal of Neuroscience. 32 (43), 14966-14978 (2012).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. Discrete synaptic states define a major mechanism of synapse plasticity. Trends in Neuroscience. 27 (12), 744-750 (2004).
- Miles, R., Poncer, J. C. Pair recordings from neurones. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 387-394 (1996).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neuroscience. 20 (10), 471-477 (1997).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Paired-pulse facilitation and depression at unitary synapses in rat hippocampus: quantal fluctuation affects subsequent release. Journal of Physiology. 491, 163-176 (1996).
- Debanne, D., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 11225-11230 (1996).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).
- DeBello, W. M., et al. SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release. Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).
- Bekkers, J. M., Stevens, C. F. Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP. Science. 252, 722-724 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).
- Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome. Brain Research. 1440, 1-8 (2012).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
- Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down’s syndrome. Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).
