Isolation und Kultur der Dissoziierte sensorischen Neuronen aus Hühnerembryonen
Summary
Zellkulturmodelle bieten detaillierte Kontrolle über Umweltbedingungen und damit eine leistungsfähige Plattform, um zahlreiche Aspekte neuronaler Zellbiologie aufzuklären. Wir beschreiben eine schnelle, kostengünstige und zuverlässige Methode, um von Hühnerembryonen zu isolieren, zu dissoziieren, und die Kultur sensorischen Neuronen. Details der Substrate Vorbereitung und Immunzytochemie sind ebenfalls vorhanden.
Abstract
Neuronen sind vielfältig Zellen, die wesentlichen Informationen für eine Vielzahl von Funktionen, einschließlich Sensation, Motorbewegung, Lernen und Gedächtnis zu tragen. Studium Neuronen in vivo kann eine Herausforderung sein aufgrund ihrer Komplexität, ihrer abwechslungsreichen und dynamischen Umgebungen und technische Grenzen. Aus diesen Gründen, Studium Neuronen in vitro kann von Vorteil sein, um die komplexen Geheimnisse von Neuronen zu entwirren. Die gut definierte Art der Zellkulturmodellen bietet detaillierte Kontrolle über Umweltbedingungen und Variablen. Hier beschreiben wir, wie zu isolieren, zu distanzieren und Kultur primären Neuronen aus Hühnerembryonen. Diese Technik ist schnell, billig und erzeugt ein robustes Wachstum sensorischen Neuronen. Das Verfahren konsequent produziert Kulturen hoch Neuronen angereichert sind und nur sehr wenige nicht-neuronale Zellen (weniger als 5%). Primären Neuronen nicht gut an unbehandeltem Glas oder Kunststoffgewebekultur, daher detaillierte Verfahren zu zwei Distin erstellenCT, gut definierte Laminin enthaltenden Substraten für neuronale Plattierung beschrieben. Kultivierten Neuronen sind sehr gut für mehrere zelluläre und molekulare Techniken, einschließlich Co-Immunopräzipitation, Live Cell Vorstellung, RNAi, und Immunzytochemie. Verfahren für die Doppel Immunzytochemie auf diesen kultivierten Neuronen wurden optimiert und hier beschrieben.
Introduction
Neuronen sind komplexe Zellen, die wesentlichen Informationen für eine Vielzahl von Funktionen, einschließlich Sensation, Vision, Motorbewegung, Lernen und Gedächtnis zu tragen. Einzigartig von anderen Zelltypen, Neuronen erstrecken Arm-wie Prozesse, die so genannte Axone, um wesentliche neuronale Autobahnen für die Kommunikation zu bilden. Während der Entwicklung spezialisiert Fächer an den Spitzen der wachsenden Axone, dem sogenannten Wachstumskegel, navigieren durch ein Konzert der extrazelluläre Signale, die Axon seine entsprechenden Ziel führen. Die komplizierten molekularen Mechanismen, die Wachstumskegel Navigation zugrunde liegen, sind nicht vollständig verstanden. Um diese Mechanismen besser zu verstehen, haben Forscher Zellkulturmodelle verwendet werden, um Nervenzellen in einem definierten und vereinfacht in vitro-Umgebung zu studieren. Neuronalen Differenzierung 2, Zytoskelett-Dynamik, Endozytose und Menschenhandel, Dendriten: Studieren Neuronen in Kultur 1 hat zu erheblichen Fortschritte in unserem Verständnis der neuronalen Zellbiologie einschließlich geführtRegulation 3,4, axonale Regeneration 5 und klinischen Zuständen, wie Neuropathien 6. Außerdem sind kultivierten Neuronen sehr gut für einen weiten Bereich von Forschungstechniken einschließlich Immunzytochemie Zelloberfläche co-Immunpräzipitation, Western Blot, Transfektion, RNAi, und die Bildgebung wie Zeitraffer Analyse der Wachstumskegel Motilität. So Kultivierung primären Neuronen ist ein leistungsfähiges Konzept für zahlreiche Aspekte der Zellbiologie von Neuronen aufzuklären.
Die Zellkultur-Modell bietet die Ermittler mit detaillierten Kontrolle über Umweltbedingungen und Variablen. Zum Beispiel kann der Substrate, auf denen Neuronen beschichtet (und wachsen auf) leicht manipuliert werden. Hier bieten wir detaillierte Anweisungen zur Erzeugung zwei unterschiedliche Substrate, eines mit einem niedrigen Laminin-1-Konzentration und das andere mit sättigenden Konzentrationen von Laminin-1. Überraschenderweise können unterschiedliche Konzentrationen des gleichen Moleküls dramatische Effekteauf dem internen Zustand der Neuronen sowie ihre Zelloberflächenzusammensetzung. Zum Beispiel sind intrazelluläre Niveaus von cAMP und der Oberflächenpegel der Integrine in Neuronen auf diesen beiden Substraten 7,8 plattiert signifikant unterschiedlich. Weitere Studien haben gezeigt, dass auch andere Moleküle, einschließlich Fibronektin und Chondroitinsulfatproteoglycane, Auswirkungen der Expression von Zelloberflächenmolekülen und neuronale Motilität 7-11. Weiterhin lassen sich lösliche Moleküle wie Neurotrophine und Neurotropine auch Auswirkungen Zellmembran Zusammensetzung und neuronalen Motilität 12-16 und kann in einem Zellkulturmodell leicht und genau bearbeitet werden.
Hier beschreiben wir Methoden zur Isolierung und Kultur dissoziiert sensorischen Neuronen von Hühnerembryonen. Dieses Verfahren wurde verwendet, um bedeutende Durchbrüche in der Neurobiologie, einschließlich Axon Auswuchs 5,7,8,10,11,16-21 machen und wurde von einem Verfahren entwickelt, um Ganglienzellen zu isolieren, 22 modifiziert. Es gibtmehrere Vorteile dieses Ansatzes. Zunächst werden viele Funktionen von Küken Hinterwurzelganglien (DRG) Entwicklung gut charakterisiert, einschließlich der Zeitrahmen für die Geburt, Axon Verlängerung und Proteinexpressionsprofile 2,23-28 und dadurch eine Grundlage, auf der lehr zu bauen informativ in-vitro-Experimenten. Zweitens, dissoziiert neuronalen Kulturen ermöglichen die Ermittler mehr direkt zu Nervenzellen zu untersuchen, verglichen mit alternativen Ansätzen mit intaktem DRG-Explantaten (die Neuronen und nicht-neuronalen Zellen enthalten) und / oder Mischkulturen, die sowohl dissoziierten Neuronen und nicht-neuronalen Zellen. Drittens ist das hier beschriebene Verfahren unkompliziert, kostengünstig und zugänglich für Studenten. Daher kann diese Technik für die Forschung als auch für Lehrzwecke verwendet werden. Außerdem sollten kleinere Variationen dieses Protokoll schnell, hohe Ausbeute Reinigung von Neuronen aus anderen Quellen als DRGs zu ermöglichen. Zum Beispiel könnte das Verfahren modifiziert, um neuronal bereitzustellen ENRiched Kulturen aus anderen Geweben, wie embryonalen Vorderhirns und des Rückenmarks.
Immunzytochemie Protokolle für diese dissoziierten neuronalen Kulturen optimiert und werden im Detail hier beschrieben. Das Verfahren für die Doppel Immunzytochemie gegen neuronale Zelladhäsionsmolekül (NCAM) und β1 Integrine ist. Aus diesen immunzytochemische Methoden erzeugten Daten werden verwendet, um die räumliche Musterung und Intensität von mehreren Molekülen in kultivierten Neuronen 8,16 untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier präsentieren wir Ihnen ausführliche Protokolle zur Isolierung und Kultivierung dissoziiert sensorischen Neuronen aus einem Hühnerembryo. Dieses Verfahren erzeugt eine angereicherte Population der stark wachsenden Nervenzellen in vitro 7,8,10,16. Zahlreiche zelluläre und molekulare Techniken können auf diese Nervenzellen in Kultur, einschließlich Immunzytochemie, die hier beschrieben wird, angewendet werden. Dieses Protokoll wurde vor kurzem zur quantitativen Bewertung der Intensität der i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Alison Philbrook, Belinda Barbagallo und Michael Francis für aufschlussreiche Kommentare zu diesem Beitrag danken. Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet wurde von einem R15 Area Award 1R15NS070172-01A1 zu MLL ausgezeichnet unterstützt.
Materials
| sterile small culture dishes (35mm) | Corning | 430165 | |
| sterile large culture dishes (100mm) | Falcon | 353003 | |
| sterile large petri dishes (100mm) | VWR | 89000-302 | |
| glass petri dish (100mm) | VWR | D108962 | |
| fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| standard forceps | Fine Science Tools | 1100-12 | |
| coverslips (22×22) | Fisher | 12 518 105K | 0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy |
| porcelin coverslip holder | Thomas scientific | 8542E40 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 17502-048 | use 50ml aliquots per 500 mls of Ham's F12 media |
| HCL | VWR | VW3204-1 | use at 2M, can be used twice before discarding |
| NaCl | Sigma | S9888 | use 5M NaCl solution for laminin-1 stock solution |
| laminin-1 | Invitrogen | 23017-015 | Add 72ul of sterile 5M NaCl and aliquot into 50ul |
| 15 ml conical tube | cell treat | 229411 | |
| PBS CMF 10X | Gibco | 14200 | used at 1X, dilute with sterile millipore filtered water |
| PBS 10X | Gibco | 14080 | used at 1X, dilute with sterile milliporee filtered water |
| Ham's F12 | Lonza | 12-615F | |
| Fetal Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 10438 | use in F12HS20 at 10% |
| HEPES | Sigma | H3375 | make sterile 1M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10mM |
| Penicillin streptomyocin | Sigma | P0781 | use 5mls in 500mls of F12 media |
| NT3 | Millipore | GF031 | Add 1ml of sterile millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 10ng/ml in F12H media, keep in -20 C non-defrosting freezer |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | aliquot under sterile conditions,stored at -20 0C, use 100ul per 10ml of F12H media |
| NGF | RnD systems | 256-GF | Add 1ml of sterile 1X PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, usd at final concentration of 10 ng/ml in F12H media |
| l-glutamine | Sigma | G7513 | aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 200mM in F12H media |
| Trypsin | Sigma | T4049 | aliquot under sterile conditions, store at -20 0C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 15260 | |
| Other items needed: general dissection instruments, including glass pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 degrees C), cell incubation chamber (humidified, 37 degrees C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope | |||
| Immunocytochemistry Reagents Table | |||
| Sucrose | Sigma | S9378 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS) |
| Triton-X 100 | Sigma | T-8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS) |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| normal goat serum | Life technologies | PCN500 | |
| microscope slides | VWR | 16004-430 | |
| Primary Antibody Table | |||
| Antibody against NCAM | Millipore | AB5032 | polyclonal |
| Antibody against activated beta 1 ingegrin | Millipore | MAB19294 | monoclonal |
| Seconday Antibody Table | |||
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Life technologies | A11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 548 | Life technologies | A11036 |
Referências
- Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).
- Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L. Sensory neuron subtypes have unique substratum preference and receptor expression before target innervation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 1781-1791 (2003).
- Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Which way to go? Cytoskeletal organization and polarized transport in neurons. Molecular and cellular neurosciences. 46, 9-20 (2011).
- Kapitein, L. C., Yau, K. W., Hoogenraad, C. C. Microtubule dynamics in dendritic spines. Methods in cell biology. 97, 111-132 (2010).
- Snow, D. M. Pioneering studies on the mechanisms of axonal regeneration. Developmental neurobiology. 71, 785-789 (2011).
- Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert opinion on drug discovery. 4, 1035-1045 (2009).
- Condic, M. L., Letourneau, P. C. Ligand-induced changes in integrin expression regulate neuronal adhesion and neurite outgrowth. Nature. 389, 852-856 (1997).
- Lemons, M. L., Condic, M. L. Combined integrin activation and intracellular cAMP cause Rho GTPase dependent growth cone collapse on laminin-1. Experimental neurology. 202, 324-335 (2006).
- Beller, J. A., et al. Comparison of sensory neuron growth cone and filopodial responses to structurally diverse aggrecan variants, in vitro. Experimental neurology. 247, 143-157 (2013).
- Condic, M. L., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Embryonic neurons adapt to the inhibitory proteoglycan aggrecan by increasing integrin expression. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 10036-10043 (1999).
- Lemons, M. L., Barua, S., Abanto, M. L., Halfter, W., Condic, M. L. Adaptation of sensory neurons to hyalectin and decorin proteoglycans. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 4964-4973 (2005).
- Guan, W., Condic, M. L. Characterization of Netrin-1, Neogenin and cUNC-5H3 expression during chick dorsal root ganglia development. Gene Expr Patterns. 3, 369-373 (2003).
- Guan, W., Wang, G., Scott, S. A., Condic, M. L. Shh influences cell number and the distribution of neuronal subtypes in dorsal root ganglia. Developmental biology. 314, 317-328 (2008).
- Kolpak, A., Zhang, J., Bao, Z. Z. Sonic hedgehog has a dual effect on the growth of retinal ganglion axons depending on its concentration. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3432-3441 (2005).
- Kolpak, A. L., et al. Negative guidance factor-induced macropinocytosis in the growth cone plays a critical role in repulsive axon turning. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 10488-10498 (2009).
- Lemons, M. L., et al. Integrins and cAMP mediate netrin-induced growth cone collapse. Brain research. 1537, 46-58 (2013).
- Snow, D. M., Atkinson, P. B., Hassinger, T. D., Letourneau, P. C., Kater, S. B. Chondroitin sulfate proteoglycan elevates cytoplasmic calcium in DRG neurons. Developmental biology. 166, 87-100 (1994).
- Snow, D. M., Brown, E. M., Letourneau, P. C. Growth cone behavior in the presence of soluble chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG), compared to behavior on CSPG bound to laminin or fibronectin. Int J Dev Neurosci. 14, 331-349 (1996).
- Snow, D. M., Lemmon, V., Carrino, D. A., Caplan, A. I., Silver, J. Sulfated proteoglycans in astroglial barriers inhibit neurite outgrowth in vitro. Experimental neurology. 109, 111-130 (1990).
- Snow, D. M., Letourneau, P. C. Neurite outgrowth on a step gradient of chondroitin sulfate proteoglycan (CS-PG). Journal of neurobiology. 23, 322-336 (1992).
- Snow, D. M., Mullins, N., Hynds, D. L. Nervous system-derived chondroitin sulfate proteoglycans regulate growth cone morphology and inhibit neurite outgrowth: A light, epifluorescence, and electron microscopy study. Microsc Res Tech. 54, 273-286 (2001).
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
- Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS genetics. 9, e1003921 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).
- Hollyday, M. Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern. The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).
- Hollyday, M., Morgan-Carr, M. Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development. The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).
- Honig, M. G., Kueter, J. The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons. Developmental biology. 167, 563-583 (1995).
- Tosney, K. W., Landmesser, L. T. Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb. Developmental biology. 109, 193-214 (1985).
- Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).
- Munoz, L. M., et al. Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons. Developmental biology. 283, 397-408 (2005).
- Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).
- Condic, M. Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression. Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).
- Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).
- Toyofuku, T., et al. FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion. Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).
- Steinmetz, M. P., et al. Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).
