Isolamento e Cultura della dissociato neuroni sensoriali da embrioni di gallina

Summary

Modelli di coltura cellulare forniscono un controllo dettagliato sulle condizioni ambientali e quindi forniscono una potente piattaforma per chiarire numerosi aspetti della biologia delle cellule neuronali. Descriviamo un metodo rapido, economico e affidabile per isolare, dissociare, e la cultura neuroni sensoriali da embrioni di pollo. Sono forniti anche i dettagli di preparazione substrati e immunocitochimica.

Abstract

I neuroni sono cellule poliedriche che portano le informazioni essenziali per una varietà di funzioni, tra cui la sensazione, movimento del motore, l'apprendimento e la memoria. Studiare i neuroni in vivo può essere difficile a causa della loro complessità, i loro ambienti diversi e dinamici, e limitazioni tecniche. Per queste ragioni, studiando i neuroni in vitro può rivelarsi utile per svelare i complessi misteri di neuroni. Il carattere ben definito di modelli di coltura cellulare fornisce un controllo dettagliato sulle condizioni ambientali e variabili. Qui si descrive come isolare, dissociare, e la cultura neuroni primari di embrioni di pollo. Questa tecnica è rapido, poco costoso, e genera robusta crescita neuroni sensoriali. La procedura produce costantemente le culture che sono altamente arricchito per i neuroni e ha pochissime cellule non neuronali (meno del 5%). Neuroni primari non aderiscono bene al vetro non trattato o di un tessuto culturale di plastica, quindi le procedure dettagliate per la creazione di due distinct, ben definito substrati-laminina contenente per la placcatura neuronale sono descritti. Neuroni in coltura sono altamente suscettibili di molteplici tecniche cellulari e molecolari, tra cui co-immunoprecipitazione, immaginare cellule vive, RNAi, e immunocitochimica. Procedure per doppia immunocitochimica su questi neuroni in coltura sono state ottimizzate e qui descritto.

Introduction

I neuroni sono cellule complesse che portano le informazioni essenziali per una varietà di funzioni, tra cui la sensazione, visione, movimento del motore, l'apprendimento e la memoria. Unico da altri tipi di cellule, i neuroni si estendono i processi braccio-come, chiamate assoni, per formare autostrade neurali essenziali per la comunicazione. Durante lo sviluppo specializzata vani situati alle estremità degli assoni in crescita, chiamati coni di crescita, navigare attraverso un concerto di segnali extracellulari per condurre l'assone alla sua destinazione appropriata. I meccanismi molecolari complessi che sono alla base della crescita del cono di navigazione non sono pienamente compresi. Per comprendere meglio questi meccanismi, i ricercatori hanno utilizzato modelli di coltura cellulare per studiare i neuroni in vitro un ambiente definito e semplificato. Studiare i neuroni in coltura ¹ ha portato a significativi progressi nella nostra comprensione della biologia delle cellule neuronali tra cui: la differenziazione neuronale ^2, la dinamica del citoscheletro, endocitosi e traffico, dendriteregolazione ^3,4, la rigenerazione assonale ^5, e delle condizioni cliniche, come neuropatie ^6. Inoltre, i neuroni in coltura sono altamente suscettibili di una vasta gamma di tecniche di ricerca tra cui immunocitochimica, cellulare superficie co-immunoprecipitazione, Western blot, trasfezione, RNAi, e l'imaging dal vivo come l'analisi Timelapse del cono di crescita motilità. Così, coltura neuroni primari è un approccio potente per chiarire numerosi aspetti della biologia cellulare dei neuroni.

Il modello di coltura cellulare fornisce investigatori con un controllo dettagliato sulle condizioni ambientali e variabili. Ad esempio, il substrato su cui sono placcati neuroni (e crescono su) può essere facilmente manipolato. Qui, forniamo istruzioni dettagliate per la generazione di due substrati distinti, uno con una bassa concentrazione laminina-1 e l'altro con saturazione concentrazioni di laminina-1. Sorprendentemente, concentrazioni diverse di una stessa molecola può avere effetti drammaticisullo stato interno dei neuroni e la loro composizione superficie cellulare. Ad esempio, i livelli intracellulari di cAMP e superficiali livelli di integrine sono significativamente differenti nei neuroni placcato su questi due substrati ^7,8. Ulteriori studi hanno dimostrato che altre molecole, comprese fibronectina e proteoglicani condroitin solfato, impatto l'espressione di molecole di superficie cellulare e motilità neuronale ^7-11. Inoltre, molecole solubili quali neurotrofine e neurotropins concernono anche la composizione della membrana cellulare e motilità neuronale ^12-16 e può essere facilmente e accuratamente manipolata in un modello di coltura cellulare.

Qui, descriviamo i metodi per isolare e cultura dissociate neuroni sensoriali provenienti da embrioni di pollo. Questa procedura è stata utilizzata per fare progressi significativi nella neurobiologia, tra cui l'estensione assonale ^{5,7,8,10,11,16-21} ed è stato modificato da una procedura volta a isolare le cellule gangliari ^22. Ci sonodiversi vantaggi di questo approccio. In primo luogo, molte caratteristiche del pulcino ganglio della radice dorsale (DRG) sviluppo sono ben caratterizzati compreso il periodo di tempo per la nascita, l'estensione assonale, e profili di espressione proteica ^2,23-28, fornendo così una base istruttivo su cui costruire informativo de esperimenti in vitro. In secondo luogo, dissociate colture neuronali consentono al ricercatore di studiare più direttamente i neuroni rispetto ad approcci alternativi utilizzando espianti intatti DRG (che contengono i neuroni e le cellule non neuronali) e / o colture miste contenenti sia i neuroni dissociati e le cellule non neuronali. In terzo luogo, la procedura qui descritta è semplice, poco costoso e suscettibile di studenti. Pertanto, questa tecnica può essere utilizzata per la ricerca e per scopi didattici. Inoltre, le variazioni minori di questo protocollo dovrebbe permettere di purificazione veloce, ad alto rendimento di neuroni da fonti diverse DRG. Ad esempio, questa procedura può essere modificata per fornire neuronally enrculture iched da altri tessuti come il prosencefalo embrionale o del midollo spinale.

Protocolli Immunocitochimica sono stati ottimizzati per queste colture neuronali dissociate e sono descritte in dettaglio qui. È prevista la procedura di doppia immunocitochimica contro la molecola di adesione neurale cellulare (NCAM) e integrine β1. I dati generati da questi metodi di immunocitochimica sono stati utilizzati per esaminare il patterning spaziale e l'intensità di diverse molecole nei neuroni in coltura ^8,16.

Protocol

1 Coverslip Preparazione: lavaggio acido e Bake Almeno 2 giorni prima della dissezione (punto 2), iniziare la seguente procedura per preparare vetrini. Eseguire la fase di lavaggio acido per rimuovere oli e coprioggetto accuratamente puliti. Coprioggetto carico di titolare di porcellana che posiziona verticalmente coprioggetto e impedisce loro di toccarsi. Immergere porta e coprioggetto in un contenitore di vetro riempito con istologia 2 M di acido cloridrico (HCl). In alternativa, se titolare di po…

Representative Results

Il protocollo qui descritto consente agli investigatori di cultura una popolazione arricchita di dissociate neuroni sensoriali embrionali con pochissime cellule (ad esempio, <5%) non neuronali 7,8,10,16. Numerosi DRG possono essere ottenuti dal lombosacrale, toracica e cervicale. A seconda delle esigenze del ricercatore, DRG di queste regioni anatomiche distinte possono essere facilmente isolate. Ad esempio, la figura 1 mostra le immagini del embrione di pollo attraverso varie fas…

Discussion

Qui vi presentiamo protocolli dettagliati per l'isolamento e la coltura dissociati neuroni sensoriali provenienti da un embrione di pulcino. Questa procedura genera una popolazione arricchita di neuroni robusta crescita in vitro ^7,8,10,16. Numerose tecniche cellulari e molecolari possono essere applicati a questi neuroni in coltura, compreso immunocitochimica, descritto qui. Questo protocollo è stato recentemente utilizzato per valutare quantitativamente l'intensità delle integrine attivate…

Materials

sterile small culture dishes (35mm)	Corning	430165
sterile large culture dishes (100mm)	Falcon	353003
sterile large petri dishes (100mm)	VWR	89000-302
glass petri dish (100mm)	VWR	D108962
fine forceps	Fine Science Tools	11251-10
standard forceps	Fine Science Tools	1100-12
coverslips  (22×22)	Fisher	12 518 105K	0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy
porcelin coverslip holder	Thomas scientific	8542E40
Fetal Bovine serum	Gibco	17502-048	use 50ml aliquots per 500 mls of Ham's F12 media
HCL	VWR	VW3204-1	use at 2M, can be used twice before discarding
NaCl	Sigma	S9888	use 5M NaCl solution for laminin-1 stock solution
laminin-1	Invitrogen	23017-015	Add 72ul of sterile 5M NaCl and aliquot into 50ul
15 ml conical tube	cell treat	229411
PBS CMF 10X	Gibco	14200	used at 1X, dilute with sterile millipore filtered water
PBS 10X	Gibco	14080	used at 1X, dilute with sterile milliporee filtered water
Ham's F12	Lonza	12-615F
Fetal Bovine Serum Albumin (BSA)	Gibco	10438	use in F12HS20 at 10%
HEPES	Sigma	H3375	make sterile 1M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10mM
Penicillin streptomyocin	Sigma	P0781	use 5mls in 500mls of F12 media
NT3	Millipore	GF031	Add 1ml of sterile millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 10ng/ml in F12H media, keep in -20 C  non-defrosting freezer
N2	Invitrogen	17502048	aliquot under sterile conditions,stored at -20 0C,  use 100ul per 10ml of F12H media
NGF	RnD systems	256-GF	Add 1ml of sterile 1X PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, usd at final concentration of 10 ng/ml in F12H media
l-glutamine	Sigma	G7513	aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 200mM in F12H media
Trypsin	Sigma	T4049	aliquot under sterile conditions, store at -20 0C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Gibco	15260
Other items needed:  general dissection instruments, including  glass pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 degrees C), cell incubation chamber (humidified, 37  degrees C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope
Immunocytochemistry Reagents Table
Sucrose	Sigma	S9378	used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)
Triton-X 100	Sigma	T-8787
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
normal goat serum	Life technologies	PCN500
microscope slides	VWR	16004-430
Primary Antibody Table
Antibody against NCAM	Millipore	AB5032	polyclonal
Antibody against activated beta 1 ingegrin	Millipore	MAB19294	monoclonal
Seconday Antibody Table
Goat anti-mouse IgG Alexa 488	Life technologies	A11001
Goat anti-rabbit IgG Alexa 548	Life technologies	A11036