लड़की भ्रूण से अलगाव और Dissociated संवेदी न्यूरॉन्स की संस्कृति

Summary

सेल संस्कृति मॉडल पर्यावरण की स्थिति अधिक विस्तृत नियंत्रण प्रदान करते हैं और इस प्रकार न्यूरोनल कोशिका जीव विज्ञान के कई पहलुओं को स्पष्ट करने के लिए एक सशक्त मंच प्रदान करते हैं. हम लड़की भ्रूण से संवेदी न्यूरॉन्स, अलग अलग कर देना, और संस्कृति के लिए एक, तेजी से सस्ती और विश्वसनीय विधि का वर्णन. Substrata तैयारी और immunocytochemistry का विवरण भी उपलब्ध कराए गए हैं.

Abstract

न्यूरॉन्स सनसनी, मोटर आंदोलन, शिक्षा, और स्मृति सहित कार्यों की एक किस्म के लिए आवश्यक जानकारी ले कि बहुमुखी कोशिकाओं रहे हैं. Vivo में न्यूरॉन्स के अध्ययन के कारण उनकी जटिलता, उनके विविध और गतिशील वातावरण, और तकनीकी सीमाओं के चुनौतीपूर्ण हो सकता है. इन कारणों से, इन विट्रो में न्यूरॉन्स का अध्ययन न्यूरॉन्स के जटिल रहस्यों को जानने के लिए फायदेमंद साबित हो सकता है. सेल संस्कृति मॉडल की अच्छी तरह से परिभाषित प्रकृति पर्यावरण की स्थिति और चर पर विस्तृत नियंत्रण प्रदान करता है. यहाँ हम अलग अलग कर देना, और लड़की भ्रूण से संस्कृति प्राथमिक न्यूरॉन्स के लिए क्या करते हैं. इस तकनीक को तेजी से सस्ती है, और robustly संवेदी न्यूरॉन्स बढ़ रही उत्पन्न करता है. प्रक्रिया लगातार अत्यधिक न्यूरॉन्स के लिए समृद्ध है कि संस्कृतियों पैदा करता है और बहुत कुछ गैर neuronal कोशिकाओं (कम से कम 5%) है. प्राथमिक न्यूरॉन्स इसलिए विस्तृत प्रक्रियाओं दो distin बनाने के लिए, इलाज कांच या टिशू कल्चर प्लास्टिक के लिए अच्छी तरह से पालन नहीं करतेसीटी, न्यूरोनल चढ़ाना के लिए अच्छी तरह से परिभाषित laminin युक्त substrata वर्णित हैं. सभ्य न्यूरॉन्स सह immunoprecipitation, लाइव सेल कल्पना, आरएनएआई, और immunocytochemistry सहित कई सेलुलर और आणविक तकनीक, के लिए अत्यधिक उत्तरदायी हैं. इन सभ्य न्यूरॉन्स पर डबल immunocytochemistry के लिए प्रक्रिया अनुकूलित और यहां वर्णित किया गया है.

Introduction

न्यूरॉन्स सनसनी, दृष्टि, मोटर आंदोलन, शिक्षा, और स्मृति सहित कार्यों की एक किस्म के लिए आवश्यक जानकारी ले कि जटिल कोशिकाओं रहे हैं. अन्य प्रकार की कोशिकाओं से अद्वितीय, न्यूरॉन्स संचार के लिए आवश्यक तंत्रिका राजमार्गों के लिए फार्म, हाथ की तरह प्रक्रियाओं, कहा जाता है axons का विस्तार. बढ़ रही axons की युक्तियों पर स्थित विकास विशेष डिब्बों के दौरान, इसकी उचित गंतव्य के लिए अक्षतंतु नेतृत्व करने के लिए बाह्य संकेत के एक संगीत कार्यक्रम के माध्यम से नेविगेट, विकास शंकु कहा जाता है. विकास शंकु नेविगेशन आबाद कि जटिल आणविक तंत्र पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं. बेहतर इन तंत्र को समझने के लिए, जांचकर्ताओं एक परिभाषित और सरलीकृत विट्रो वातावरण में न्यूरॉन्स अध्ययन करने के लिए सेल संस्कृति मॉडल का इस्तेमाल किया है. Neuronal भेदभाव ^2, cytoskeletal गतिशीलता, endocytosis और तस्करी, डेन्ड्राइट: संस्कृति ¹ में अध्ययन न्यूरॉन्स सहित neuronal सेल जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ में महत्वपूर्ण प्रगति के लिए प्रेरित कियाविनियमन ^3,4, axonal उत्थान ^5, और इस तरह के न्यूरोपैथी ⁶ के रूप में नैदानिक ​​स्थितियों. इसके अलावा, सभ्य न्यूरॉन्स immunocytochemistry, कोशिका की सतह सह immunoprecipitation, पश्चिमी धब्बा, अभिकर्मक, आरएनएआई, और इस तरह के विकास शंकु गतिशीलता के timelapse विश्लेषण के रूप में रहते इमेजिंग सहित अनुसंधान तकनीकों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अत्यधिक उत्तरदायी हैं. इस प्रकार, प्राथमिक न्यूरॉन्स संवर्धन न्यूरॉन्स की कोशिका जीव विज्ञान के कई पहलुओं को स्पष्ट करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है.

सेल संस्कृति मॉडल पर्यावरण की स्थिति और चर पर विस्तृत नियंत्रण के साथ जांचकर्ताओं प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, न्यूरॉन्स चढ़ाया (और पर बढ़ने) कर रहे हैं जिस पर substrata आसानी से छेड़छाड़ की जा सकती है. यहाँ, हम दो अलग substrata, एक कम laminin -1 एकाग्रता के साथ एक और laminin-1 की सांद्रता saturating के साथ अन्य पैदा करने के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान करते हैं. हैरानी की बात है, एक ही अणु के विभिन्न सांद्रता नाटकीय प्रभाव हो सकता हैआंतरिक न्यूरॉन्स के राज्य के साथ ही उनके सेल सतह की संरचना पर. उदाहरण के लिए, integrins की छावनी और सतह के स्तर के intracellular स्तर इन दो substrata ^7,8 पर चढ़ाया न्यूरॉन्स में काफी अलग हैं. अतिरिक्त अध्ययन फ़ाइब्रोनेक्टिन और chondroitin सल्फेट proteoglycans, प्रभाव कोशिका की सतह अणुओं की अभिव्यक्ति और neuronal गतिशीलता ^7-11 सहित कि अन्य अणुओं, पता चला है. इसके अलावा, इस तरह के भी कोशिका झिल्ली संरचना और neuronal गतिशीलता ^12-16 प्रभाव और आसानी से और सही एक सेल संस्कृति मॉडल में हेरफेर किया जा सकता Neurotrophins और neurotropins के रूप में घुलनशील अणु.

यहाँ, हम तरीकों को अलग करने और संस्कृति लड़की भ्रूण से संवेदी न्यूरॉन्स अलग वर्णन. यह प्रक्रिया अक्षतंतु परिणाम ^{5,7,8,10,11,16-21} सहित तंत्रिका जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण सफलताओं बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है और नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं ²² अलग करने के लिए बनाया गया एक प्रक्रिया से संशोधित किया गया था. वहांइस दृष्टिकोण के लिए कई फायदे. सबसे पहले, लड़की पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि (डीआरजी) के विकास की कई सुविधाएँ अच्छी तरह से जन्म, अक्षतंतु विस्तार के लिए समय सीमा सहित विशेषता है, और प्रोटीन अभिव्यक्ति इस प्रकार इन विट्रो प्रयोगों में जानकारीपूर्ण निर्माण करने के लिए जिस पर एक शिक्षाप्रद आधार प्रदान करने, ^2,23-28 प्रोफाइल. दूसरा, neuronal संस्कृतियों अन्वेषक अधिक सीधे अलग न्यूरॉन्स और गैर neuronal कोशिकाओं दोनों युक्त (न्यूरॉन्स और गैर neuronal कोशिकाओं होते हैं) बरकरार DRG explants और / या मिश्रित संस्कृतियों का उपयोग वैकल्पिक तरीकों की तुलना में न्यूरॉन्स अध्ययन करने के लिए अनुमति देने के अलग. तीसरा, यहां वर्णित प्रक्रिया, सरल, सस्ता और स्नातक से नीचे के लिए उत्तरदायी है. इसलिए, इस तकनीक अनुसंधान के लिए और साथ ही शिक्षण उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल की मामूली बदलाव DRGs के अलावा अन्य स्रोतों से न्यूरॉन्स की तेजी, उच्च उपज शुद्धि की अनुमति चाहिए. उदाहरण के लिए, इस प्रक्रिया Enr neuronally प्रदान करने के लिए संशोधित किया जा सकता हैऐसे भ्रूण अग्रमस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी के रूप में अन्य ऊतकों से iched संस्कृतियों.

Immunocytochemistry प्रोटोकॉल इन अलग neuronal संस्कृतियों के लिए अनुकूलित किया गया है और यहां विस्तार से वर्णन किया गया हैं. तंत्रिका कोशिका आसंजन अणु (NCAM) और β1 integrins के खिलाफ डबल immunocytochemistry के लिए प्रक्रिया प्रदान की जाती है. इन immunocytochemical तरीकों से उत्पन्न डेटा सभ्य न्यूरॉन्स ^8,16 में स्थानिक patterning और कई अणुओं की तीव्रता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.

Protocol

1 Coverslip तैयारी: एसिड धोने और सेंकना कम से कम 2 दिन पहले विच्छेदन (चरण 2) को, coverslips तैयार करने के लिए निम्नलिखित कदम शुरू. तेल और अच्छी तरह से साफ coverslips दूर करने के लिए एसिड धोने कदम प्रदर्शन. खड़ी coverslips पदों औ?…

Representative Results

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल संस्कृति को बहुत कुछ (जैसे, <5%) गैर neuronal कोशिकाओं 7,8,10,16 साथ अलग भ्रूण संवेदी न्यूरॉन्स की एक समृद्ध आबादी जांचकर्ताओं सक्षम बनाता है. कई DRGs lumbosacral, वक्ष और गर्भाशय ग्रीवा के क्षे?…

Discussion

यहाँ हम अलग करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल वर्तमान और संवर्धन एक लड़की भ्रूण से संवेदी न्यूरॉन्स अलग. यह प्रक्रिया इन विट्रो ^7,8,10,16 में मजबूती बढ़ रही न्यूरॉन्स की एक समृद्ध आबादी उत्पन्न करता…

Materials

sterile small culture dishes (35mm)	Corning	430165
sterile large culture dishes (100mm)	Falcon	353003
sterile large petri dishes (100mm)	VWR	89000-302
glass petri dish (100mm)	VWR	D108962
fine forceps	Fine Science Tools	11251-10
standard forceps	Fine Science Tools	1100-12
coverslips  (22×22)	Fisher	12 518 105K	0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy
porcelin coverslip holder	Thomas scientific	8542E40
Fetal Bovine serum	Gibco	17502-048	use 50ml aliquots per 500 mls of Ham's F12 media
HCL	VWR	VW3204-1	use at 2M, can be used twice before discarding
NaCl	Sigma	S9888	use 5M NaCl solution for laminin-1 stock solution
laminin-1	Invitrogen	23017-015	Add 72ul of sterile 5M NaCl and aliquot into 50ul
15 ml conical tube	cell treat	229411
PBS CMF 10X	Gibco	14200	used at 1X, dilute with sterile millipore filtered water
PBS 10X	Gibco	14080	used at 1X, dilute with sterile milliporee filtered water
Ham's F12	Lonza	12-615F
Fetal Bovine Serum Albumin (BSA)	Gibco	10438	use in F12HS20 at 10%
HEPES	Sigma	H3375	make sterile 1M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10mM
Penicillin streptomyocin	Sigma	P0781	use 5mls in 500mls of F12 media
NT3	Millipore	GF031	Add 1ml of sterile millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 10ng/ml in F12H media, keep in -20 C  non-defrosting freezer
N2	Invitrogen	17502048	aliquot under sterile conditions,stored at -20 0C,  use 100ul per 10ml of F12H media
NGF	RnD systems	256-GF	Add 1ml of sterile 1X PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, usd at final concentration of 10 ng/ml in F12H media
l-glutamine	Sigma	G7513	aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 200mM in F12H media
Trypsin	Sigma	T4049	aliquot under sterile conditions, store at -20 0C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Gibco	15260
Other items needed:  general dissection instruments, including  glass pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 degrees C), cell incubation chamber (humidified, 37  degrees C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope
Immunocytochemistry Reagents Table
Sucrose	Sigma	S9378	used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)
Triton-X 100	Sigma	T-8787
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
normal goat serum	Life technologies	PCN500
microscope slides	VWR	16004-430
Primary Antibody Table
Antibody against NCAM	Millipore	AB5032	polyclonal
Antibody against activated beta 1 ingegrin	Millipore	MAB19294	monoclonal
Seconday Antibody Table
Goat anti-mouse IgG Alexa 488	Life technologies	A11001
Goat anti-rabbit IgG Alexa 548	Life technologies	A11036