Isolement des populations cellulaires distinctes du cervelet en développement par microdissection
Summary
progéniteurs exprimant la nestine sont une population nouvellement identifié des progéniteurs neuronaux dans le cervelet en développement. En utilisant la technique de microdissection présentés ici, en combinaison avec un tri cellulaire activé par fluorescence, cette population cellulaire peut être purifié sans contamination par d'autres régions du cervelet et peut être mis en culture pour des études ultérieures.
Abstract
Microdissection est une nouvelle technique qui peut isoler des régions spécifiques d'un tissu et d'éliminer la contamination à partir de sources cellulaires dans les zones adjacentes. Cette méthode a été utilisée la première fois dans l'étude de progéniteurs exprimant la nestine (PES), une population de cellules nouvellement identifié dans la couche externe du cervelet germinal (EGL). Utilisation de microdissection en combinaison avec un tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), une population pure de PES a été collecté séparément de précurseurs neuronaux granulés classiques de l'EGL et d'autres cellules exprimant la nestine-contaminantes dans le cervelet. Sans microdissection, des analyses fonctionnelles de PES n'auraient pas été possible avec les méthodes actuellement disponibles, tels que gradient de Percoll centrifugation et microdissection laser. Cette technique peut également être appliquée pour une utilisation avec divers tissus qui contiennent des régions reconnaissables ou des cellules marquées par fluorescence. Plus important encore, un avantage majeur de cette microdissection technique est que les cellules isolées vivent et peuvent être cultivées pour plus d'expérimentation, qui n'est actuellement pas possible avec d'autres méthodes décrites.
Introduction
Le cervelet est constitué de plusieurs couches de cellules, chacune contenant des types cellulaires distincts. Au cours du développement, la prolifération des précurseurs EGL contient des granules de neurones (PNB), tandis que la couche moléculaire et la couche de Purkinje contiennent neurones Bergmann gliales et de Purkinje, respectivement. Profondément dans le cervelet se trouve la substance blanche, qui contient des cellules souches neurales (NSC) et les oligodendrocytes 1.
Sonic hedgehog (Shh) joue un rôle essentiel dans la régulation du développement du cervelet et en particulier, il favorise la prolifération des PNB par liaison à son récepteur Patched (Ptc), un régulateur négatif de la signalisation de Shh 2-4. Activation aberrante de signalisation de Shh génère médulloblastome (MB), la tumeur la plus fréquente de cerveau maligne chez les enfants 5,6.
Modèles de souris transgéniques Ptc de MB mutants sont des outils puissants pour l'étude de la MB et développent des tumeurs ressemblant MB humaine 7,8. L'utilisation de cessouris, on a découvert que le PNB sont la cellule d'origine pour hérisson de type MB 7. En outre, en plus de PNB, nous avons récemment identifié une population unique de progéniteurs neuronaux au sein de l'EGL du cervelet développement qui peut également donner lieu à MB. Ces cellules expriment des niveaux élevés de la protéine de type VI de filament intermédiaire, la nestine, et sont appelés PES 9. PES sont situés dans la partie profonde de la EGL et existent de façon transitoire seulement au cours du développement du cervelet néonatale. Ils se sont engagés à la lignée de cellules granulaires comme le PNB, mais sont distincts car ils sont au repos et n'expriment pas Math1, un marqueur bien établi de PNB classiques 10. En outre, les PES donnent lieu à MB plus efficacement que le PNB après l'activation de la voie de signalisation de Shh 9, qui en fait un roman pour origine MB tumorigenèse fait.
Nous avons déjà isolé PES de l'EGL cérébelleuse à jour postnatal 4 (P4) par la technique de microdissectiondécrit ici 9. Microdissection par visualisation microscopique direct du tissu permet de dissection spécifique de l'EGL cérébelleuse. Cela est nécessaire car Nestin est également exprimé par les CNS dans la substance blanche du cervelet et par Bergmann cellules gliales dans la couche moléculaire 1,7,11,12 et il est essentiel que ces cellules ne sont pas inclus, car ils confondent l'analyse. Des cellules isolées à partir de tissu microdissection peuvent être utilisés immédiatement pour l'analyse moléculaire ou ils peuvent être cultivés pour d'autres applications.
Pour aider à microdissecting spécifiquement l'EGL et pour purifier davantage les PES, les souris Math1-GFP (protéine fluorescente verte) ont été croisées avec des souris Nestin-CFP (cyan fluorescent protein). Le facteur de transcription Math1 est spécifiquement exprimée par le PNB et l'expression de la GFP est clairement visible dans le EGL 9,13. Souris Nestin-PCP expriment une forme nucléaire de la PCP et peuvent être facilement visualisées dans la couche moléculaire 9,14. Ensemble, GFP et l'expression de la PCP créent des frontières pour microdissection de la EGL (voir Figure 1). PES CFP-positifs ont ensuite été isolées par FACS, après la dissociation enzymatique des RAT disséqués.
Actuellement, la méthode la plus utilisée à bon escient pour isoler les cellules de l'EGL est gradient de Percoll centrifugation du tissu cérébelleux ensemble 15,16. Cette méthode, cependant, ne peut pas exclure totalement populations de cellules nestine + de la couche moléculaire et la substance blanche et ne peut donc pas être utilisé pour l'étude de la PNI. Microdissection par capture laser, qui utilise le transfert d'énergie laser pour retirer les cellules d'intérêt, est un autre procédé utilisé pour isoler des cellules spécifiques au sein d'un tissu hétérogène 17,18 cellules capturées mais ne peuvent être utilisés pour la récupération de l'ADN, de l'ARN et de la protéine et ne sont pas pouvoir être cultivées.
Ce protocole fournit un moyen d'isoler spécifiquement, une population pure vie des PES de l'EGL.Cette technique peut également être appliquée à différents types de tissus qui ont soit l'architecture reconnaissable anatomique ou marquées par fluorescence de cellules / régions. Par conséquent, le principal avantage de l'intégration de cette nouvelle technique de microdissection dans les protocoles d'isolement des cellules est que les cellules peuvent être isolées à partir de régions spécifiques du tissu pour éliminer les tissus voisins et de contaminer les cellules peuvent être recueillies immédiatement pour l'analyse en culture ou pour d'autres applications.
Protocol
Representative Results
Discussion
Procédé de microdissection décrite ici est le premier procédé capable d'isoler une population pure de cellules vivantes pour l'utilisation dans des analyses moléculaires et fonctionnels. Comme l'a démontré par Li et al. 9, PES obtenus par ce procédé peuvent être mises en culture et incorporés dans diverses expériences et en raison de leur haut degré de pureté, peuvent également être utilisés pour l'analyse de puces à ADN.
Il e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier James Oesterling pour cytométrie de flux de l'aide. Cette recherche a été financée par une subvention de l'Institut national américain du cancer (R01-CA178380, ZY) et une subvention US National Institutes postdoctorale de formation (5T32CA009035-37, LWY).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
Referências
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