Mikrodisseksiyon tarafından Gelişmekte Serebellumunda farklı olarak hücre popülasyonlarının İzolasyonu
Summary
Nestin-salgılayan progenitorlar gelişen beyincikte nöronal progenitörlerinin yeni tespit edilen bir gruptur. Floresan-aktive edilmiş hücre sıralama ile kombinasyon halinde burada sunulan mikrodiseksiyon tekniği kullanarak, bu hücre popülasyonu, diğer beyincik bölgelerinin herhangi bir bulaşma ile saflaştırılabilir ve daha ileri araştırmalar için kültürlenebilir.
Abstract
Mikrodisseksiyon bir doku spesifik bölgelerini izole ve komşu bölgelerde hücresel kaynaklardan kirlenmeyi ortadan kaldırabilir yeni bir tekniktir. Bu yöntem, ilk çalışmada kullanılmıştır Nestin salgılayan progenitorlar (döküntüler), serebellar dış germinal tabakadan (EGL) hücrelerin yeni tespit edilen bir popülasyon. Floresan-aktive edilmiş hücre tasnifi (FACS) ile kombinasyon halinde kullanılması mikrodiseksiyon, neps saf nüfus serebellumda EGL geleneksel granül nöron habercilerden ve diğer kirletici Nestin salgılayan hücrelerin ayrı olarak toplanmıştır. Mikrodiseksiyonu olmadan, NEP'lerin fonksiyonel analizleri gibi Percoll santrifüj ve lazer yakalama mikrodiseksiyon olarak kullanılabilir mevcut yöntemleri ile mümkün olmazdı. Bu teknik aynı zamanda tanınan bölgeleri veya floresan ile etiketlenmiş ya da hücreleri içeren çeşitli dokularda kullanılmak için de uygulanabilir. Bu microdissectio en önemlisi büyük bir avantajdırn, teknik izole edilmiş canlı hücreler ve başka tarif edilen yöntemler ile mümkün değil ayrıca deney için kültürlenebilir olmasıdır.
Introduction
Beyincik, çok hücreli bir katman, her biri farklı hücre tiplerinde meydana gelir. Moleküler tabaka ve purkinje katman sırasıyla Bergmann glia ve purkinje nöronları içeren ise gelişme sırasında, EGL granül nöron öncüleri (kişi başına milli geliri) çoğalan içerir. Beyincik içinde derin nöral kök hücreler (NSC'lerde) ve oligodendrositleri 1 içeren beyaz madde, yatıyor.
Sonic dikenli proteini (Shh) serebellar gelişme düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığı ve özellikle de, kendi reseptörü olan yamalı (PTC), Shh, 2-4, sinyal bir negatif düzenleyicisi bağlanarak kişi başına milli geliri çoğalmasını teşvik eder. Sus sinyal anormal aktivasyonunun Medulloblastom (MB), çocuklarda 5,6 en sık görülen kötü huylu beyin tümörü oluşturur.
Ptc mutant MB transgenik fare modelleri MB çalışma için güçlü araçlar vardır ve insan MB 7,8 benzeyen tümörler gelişebilir. Kullanarak bufarenin, bu kişi başına milli geliri kirpi tipi MB 7 kökenli hücre olduğu keşfedildi. Ayrıca, ek olarak kişi başına milli geliri, yakın zamanda da MB ortaya çıkmasına neden olabilir gelişen beyincikte de EGL içinde nöronal progenitörlerin benzersiz bir popülasyonu tespit ettik. Bu hücreler, tip VI filaman protein Nestin yüksek seviyelerde ifade etmek ve NEP 9 olarak adlandırılır. NEP EGL derin bölümü içinde yer alan ve sadece yenidoğan serebellar gelişme sırasında geçici olarak mevcut olurlar. Onlar kişi başına milli geliri olarak granül hücre soyu kararlıdır ama onlar sakin ve Math1, konvansiyonel kişi başına milli geliri 10 köklü bir işaretleyici ifade yok gibi farklıdır edilmektedir. Buna ek olarak, NEP onları MB tümörogenez için yeni bir kökeni yapar Şşş sinyal yolunun 9 aktivasyonu sonrası MB yol daha verimli kişi başına milli geliri verir.
Biz daha önce mikrodisseksiyon tekniği ile doğum sonrası 4. günde (P4) de serebellar EGL gelen NEPS izoleburada 9 nitelendirdi. Dokunun direkt mikroskopik ile mikrodiseksiyon serebellar EGL belirli diseksiyon sağlar. Nestin da serebellar beyaz cevher ve moleküler tabaka 1,7,11,12 Bergmann glia ile NSC'lerde ifade ve analizleri etkileyebilecek gibi o, bu hücreler dahil edilmemesi çok önemliydi gibi bu gereklidir. Microdissected dokudan izole edilen hücreler moleküler analiz için hemen kullanılabilir ya da daha fazla uygulama için kültürlenebilir.
Özellikle EGL Microdissecting yardımcı olmak için ve daha fazla nepler arıtmak için Math1-GFP (yeşil floresan protein) farenin Nestin-CFP (mavi floresan protein) fareler ile çaprazlandı. Math1 spesifik kişi başına milli geliri ve GFP ifadesi ile anlatılmak istenen, transkripsiyon faktörü EGL 9,13 açıkça görülebilir. Nestin-CFP farenin CFP nükleer şeklinde ifade ve kolayca moleküler tabakanın 9,14 olarak görselleştirilebilir. Birlikte, GFP ve CFP ifade EGL mikrodiseksiyonu için sınırlarını oluşturmak (Şekil 1). CFP pozitif NEP daha sonra kesilmiş EGLs enzimatik ayrışma sonrasında, FACS ile izole edilmiştir.
Şu anda, EGL hücreleri izole etmek için en çok kullanılan yöntem, tüm beyincik dokusuna 15,16 Percoll gradient santrifüjleme. Ancak bu metot, tam olarak moleküler tabakanın beyaz maddeden Nestin + hücre popülasyonlarının dahil yapamaz ve dolayısıyla neps çalışma için kullanılamaz. Ilgi hücreleri çıkarmak için lazer enerjisinin transferini kullanan lazer yakalama mikrodiseksiyon, heterojen bir doku 17,18 içinde belirli hücreleri izole etmek için kullanılabilir, ancak yakalanan hücreleri sadece DNA, RNA ve proteinin geri kazanılması için kullanılan ve değildir başka bir yöntemdir edebilmek yetiştiriciliğine.
Bu protokol, özellikle EGL gelen NEP'lerin bir canlı, saf bir nüfusunu yalıtmak için bir yol sağlar.Bu teknik aynı zamanda tanınan anatomik mimari veya flüoresan etiketli hücre / alanlara sahip farklı doku türlerine uygulanabilir. Bu nedenle, hücre izolasyon protokolleri, bu yeni mikrodiseksiyon tekniği içeren en büyük avantajı, hücreler, doku komşu kirletici ortadan kaldırmak için özel doku bölgeleri izole edilebilir ve hücreler, diğer uygulamalar için veya kültür analizi için hemen elde edilebilmesidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada anlatılan yöntem mikrodiseksiyon moleküler ve fonksiyonel analizlerde kullanım için canlı hücreler saf bir popülasyonu izole etmek mümkün ilk işlemdir. Li ve ark. 9 ile gösterildiği gibi, Bu yöntemle elde edilen NEP kültürlenmiştir ve çeşitli deneyler dahil edilir ve olduğu gibi yüksek saflıkta, aynı zamanda mikro-dizi analizi için de kullanılabilir edilebilir.
Bu mikrodisseksiyon tekniğiyle ustalaşmanın zaman çok önemlidir….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar yardım flow sitometri James Oesterling teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma ABD Ulusal Kanser Enstitüsü (R01-CA178380, ZY) ve ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri Doktora Sonrası eğitim bursu (5T32CA009035-37, LWY) bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
Referências
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-114 (1999).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
- Riobo, N. A., Manning, D. R. Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs. Biochem J. 403, 369-379 (2007).
- Dahmane, N., et al. The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis. Development. 128, 5201-5212 (2001).
- Marino, S. Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control. Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).
- Yang, Z. J., et al. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Sutter, R., et al. Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas. Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).
- Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells. J Neurosci. 14, 124-133 (1994).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nat Protoc. 1, 586-603 (2006).
