Microdissection से विकासशील सेरिबैलम से अलग सेल आबादी के अलगाव
Summary
Nestin व्यक्त progenitors विकासशील सेरिबैलम में neuronal progenitors के एक नव पहचान आबादी हैं. फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई के साथ संयोजन में यहाँ प्रस्तुत microdissection तकनीक का उपयोग करना, इस सेल की आबादी अन्य अनुमस्तिष्क क्षेत्रों से कोई संदूषण के साथ शुद्ध किया जा सकता है और आगे के अध्ययन के लिए संवर्धित किया जा सकता है.
Abstract
Microdissection एक ऊतक के विशिष्ट क्षेत्रों को अलग और आसन्न क्षेत्रों में सेलुलर स्रोतों से प्रदूषण को समाप्त कर सकते हैं कि एक उपन्यास तकनीक है. इस विधि पहले के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था nestin व्यक्त progenitors (NEPs), अनुमस्तिष्क बाहरी कीटाणु परत (EGL) में कोशिकाओं के एक नव पहचान आबादी. फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई (FACS) के साथ संयोजन में microdissection का प्रयोग, NEPs की एक शुद्ध आबादी सेरिबैलम में EGL में पारंपरिक दाना न्यूरॉन व्यापारियों से और अन्य contaminating nestin व्यक्त कोशिकाओं से अलग से एकत्र किया गया था. Microdissection बिना, NEPs के कार्यात्मक विश्लेषण ऐसे Percoll ढाल centrifugation और लेजर कब्जा microdissection के रूप में उपलब्ध मौजूदा तरीकों, साथ संभव नहीं होता. इस तकनीक को भी पहचानने योग्य क्षेत्रों या fluorescently लेबल कोशिकाओं या तो होते हैं कि विभिन्न ऊतकों के साथ उपयोग के लिए लागू किया जा सकता है. इस microdissectio की सबसे महत्वपूर्ण बात, एक प्रमुख लाभn तकनीक अलग कक्षों रह रहे हैं और अन्य वर्णित तरीकों के साथ वर्तमान में संभव नहीं है जो आगे प्रयोग, के लिए संवर्धित किया जा सकता है.
Introduction
सेरिबैलम कई सेल परतों, प्रत्येक युक्त विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के शामिल है. आणविक परत और Purkinje परत क्रमशः, Bergmann glia और Purkinje न्यूरॉन्स होते हैं जबकि विकास के दौरान, EGL दाना न्यूरॉन व्यापारियों (GNPs) proliferating होता. सेरिबैलम के भीतर दीप तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) और oligodendrocytes 1 जिसमें सफेद पदार्थ, निहित है.
ध्वनि का हाथी (श्श्श) अनुमस्तिष्क विकास को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और विशेष रूप से, यह समझौता इसकी रिसेप्टर (पीटीसी), श्श्श 2-4 संकेत की एक नकारात्मक नियामक के लिए बाध्य के माध्यम से GNPs के प्रसार को बढ़ावा देता है. श्श्श सिगनल की न्यायपालिका सक्रियण medulloblastoma (एमबी), बच्चों 5,6 में सबसे आम घातक ब्रेन ट्यूमर को उत्पन्न करता है.
पीटीसी उत्परिवर्ती एमबी ट्रांसजेनिक माउस मॉडल एमबी के अध्ययन के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं और मानव एमबी 7,8 जैसी ट्यूमर का विकास. का उपयोग इनचूहों, यह GNPs हाथी प्रकार एमबी 7 के लिए मूल के सेल हैं कि खोज की थी. इसके अलावा, GNPs के अलावा, हम हाल ही में भी एमबी को जन्म दे सकता है कि विकासशील सेरिबैलम के EGL भीतर neuronal progenitors के एक अद्वितीय आबादी की पहचान की है. इन कोशिकाओं प्रकार छठी मध्यवर्ती रेशा प्रोटीन, nestin के उच्च स्तर व्यक्त, और NEPs 9 कहा जाता है. NEPs EGL के गहरे हिस्से के भीतर स्थित है और केवल नवजात अनुमस्तिष्क विकास के दौरान क्षणिक मौजूद रहे. वे GNPs रूप दाना सेल वंश के लिए प्रतिबद्ध है, लेकिन वे मौन हैं और Math1, पारंपरिक GNPs 10 के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मार्कर व्यक्त नहीं करते के रूप में अलग कर रहे हैं. इसके अलावा, NEPs उन्हें एमबी tumorigenesis के लिए एक उपन्यास मूल बनाता है जो श्श्श संकेतन मार्ग 9, की सक्रियता के बाद एमबी को जन्म अधिक कुशलता से GNPs दे.
हम पहले microdissection तकनीक से प्रसव के बाद सुबह 4 (पी 4) पर अनुमस्तिष्क EGL से NEPs पृथकयहां 9 में वर्णित है. ऊतक के प्रत्यक्ष सूक्ष्म दृश्य के माध्यम से Microdissection अनुमस्तिष्क EGL की विशिष्ट विच्छेदन के लिए अनुमति देता है. Nestin भी अनुमस्तिष्क सफेद पदार्थ में और आणविक परत 1,7,11,12 में Bergmann glia द्वारा एनएससी द्वारा व्यक्त की और कहा कि वे विश्लेषण उलझाना चाहते हैं, क्योंकि यह इन कोशिकाओं को शामिल नहीं किया है कि महत्वपूर्ण था है के रूप में यह आवश्यक है. Microdissected ऊतक से अलग कक्षों आणविक विश्लेषण के लिए तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या वे आगे अनुप्रयोगों के लिए संवर्धित किया जा सकता है.
विशेष रूप से EGL microdissecting में सहायता करने के लिए और आगे NEPs शुद्ध करने के लिए, Math1-GFP (हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) चूहों nestin-रवांडा (सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन) चूहों के साथ पार कर रहे थे. Math1 विशेष रूप से GNPs और GFP अभिव्यक्ति द्वारा व्यक्त की है प्रतिलेखन कारक EGL 9,13 में स्पष्ट रूप से दिख रहा है. nestin-पाकिस्तानी चूहों हांगकांग के एक परमाणु फार्म व्यक्त करते हैं और आसानी से आणविक परत 9,14 में देखे जा सकते हैं. साथ में, GFP और पाकिस्तानी अभिव्यक्ति EGL के microdissection के लिए सीमाओं बनाने (चित्रा 1 देखें). पाकिस्तानी पॉजिटिव NEPs तो विच्छेदित EGLs के enzymatic हदबंदी के बाद, FACS द्वारा अलग थे.
वर्तमान में, EGL से कोशिकाओं को अलग करने के लिए सबसे अच्छी तरह से उपयोग विधि पूरी अनुमस्तिष्क ऊतक 15,16 के Percoll ढाल centrifugation है. इस विधि, तथापि, पूरी तरह से आणविक परत और सफेद पदार्थ से nestin + सेल आबादी को बाहर करने में असमर्थ है और इसलिए NEPs के अध्ययन के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता. ब्याज की कोशिकाओं को हटाने के लिए लेजर ऊर्जा के हस्तांतरण का उपयोग करता है जो लेजर कब्जा microdissection, एक विषम ऊतक 17,18 के भीतर विशिष्ट कोशिकाओं को अलग किया लेकिन कब्जा कर लिया कोशिकाओं ही डीएनए, आरएनए और प्रोटीन की वसूली के लिए इस्तेमाल किया और नहीं किया जा सकता है एक और तरीका है सक्षम सुसंस्कृत होने के लिए.
इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से EGL से NEPs का एक जिंदा, शुद्ध आबादी को अलग करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है.इस तकनीक को भी पहचानने योग्य शारीरिक संरचना या fluorescently लेबल कोशिकाओं / क्षेत्रों या तो है कि विभिन्न प्रकार के ऊतकों को लागू किया जा सकता है. इसलिए, सेल अलगाव प्रोटोकॉल में इस उपन्यास microdissection तकनीक शामिल करने का प्रमुख लाभ कोशिकाओं ऊतक पड़ोसी contaminating को खत्म करने के लिए विशिष्ट ऊतक क्षेत्रों से अलग किया जा सकता है और कोशिकाओं अन्य अनुप्रयोगों के लिए विश्लेषण या सुसंस्कृत लिए तुरंत एकत्र किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित microdissection विधि आणविक और कार्यात्मक विश्लेषण में उपयोग के लिए जीवित कोशिकाओं का एक शुद्ध आबादी को अलग करने में सक्षम पहली प्रक्रिया है. ली एट अल. 9 द्वारा प्रदर्शन के रूप में, इस विधि द…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों सहायता प्रवाह cytometry के लिए जेम्स Oesterling धन्यवाद देना चाहूंगा. इस शोध अमेरिका के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (R01-CA178380, ZY) और एक अमेरिकी राष्ट्रीय संस्थानों Postdoctoral प्रशिक्षण अनुदान (5T32CA009035-37, LWY) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
Referências
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