El aislamiento de las poblaciones celulares distinto del cerebelo en desarrollo por Microdissection
Summary
Progenitores nestina que expresan son una población recientemente identificado de progenitores neuronales en el cerebelo en desarrollo. Utilizando la técnica de microdisección se presenta aquí en combinación con la clasificación de células activadas por fluorescencia-, esta población de células puede purificarse sin contaminación de otras regiones del cerebelo y puede ser cultivado para estudios posteriores.
Abstract
Microdissection es una nueva técnica que puede aislar regiones específicas de un tejido y eliminar la contaminación de fuentes celulares en las zonas adyacentes. Este método fue utilizado por primera vez en el estudio de la expresión de nestina progenitoras (NEP), una población recientemente identificado de células en la capa germinal externa cerebelosa (EGL). Uso de microdisección en combinación con la clasificación de células fluorescentes activadas (FACS), una población pura de NEP se recogió por separado a partir de precursores neuronales de gránulos convencionales en la EGL y de otras células que expresan nestina contaminantes en el cerebelo. Sin microdisección, análisis funcionales de los PIJ no habría sido posible con los métodos actualmente disponibles, como la centrifugación en gradiente de Percoll y captura microdissection láser. Esta técnica también se puede aplicar para su uso con diversos tejidos que contienen cualquiera de las regiones reconocibles o células marcadas con fluorescencia. Lo más importante, una gran ventaja de este microdissectiotécnica n es que las células aisladas viven y pueden ser cultivadas para la experimentación, que en la actualidad no es posible con otros métodos descritos.
Introduction
El cerebelo se compone de múltiples capas de células, cada uno con distintos tipos de células. Durante el desarrollo, el EGL contiene la proliferación de precursores neuronales de gránulos (PNB), mientras que la capa molecular y la capa de Purkinje contienen neuronas Bergmann neuroglia y de Purkinje, respectivamente. En lo profundo de cerebelo se encuentra la sustancia blanca, que contiene células madre neurales (NSC) y oligodendrocitos 1.
Sonic hedgehog (Shh) juega un papel crítico en la regulación de desarrollo del cerebelo y, en particular, promueve la proliferación de PNB través de la unión a su receptor Patched (Ptc), un regulador negativo de la señalización de Shh 2-4. La activación aberrante de la señalización de Shh genera meduloblastoma (MB), el tumor cerebral maligno más común en los niños 5,6.
MB mutantes modelos de ratones transgénicos de PTC son herramientas poderosas para el estudio de la MB y se desarrollan los tumores se asemejan MB humana 7,8. El uso de estosratones, se descubrió que PNB son la célula de origen de hedgehog de tipo MB 7. Además, en adición a PNB, recientemente hemos identificado una población única de células progenitoras neuronales dentro de la EGL del cerebelo en desarrollo que también puede dar lugar a MB. Estas células expresan altos niveles de la proteína de filamentos intermedios VI tipo, Nestin, y se denominan NEP 9. NEP se encuentran dentro de la parte profunda de la EGL y existen transitoriamente sólo durante el desarrollo del cerebelo neonatal. Están comprometidos con el linaje de células granulares como PNB, pero son distintas, ya que son de reposo y no expresan Math1, un marcador bien establecido para la PNB convencionales 10. Además, NEP dan lugar a MB más eficientemente que PNB después de la activación de la vía de señalización Shh 9, lo que les una novela origen para MB tumorigénesis hace.
Se aislaron previamente NEPs del cerebelo EGL en el día postnatal 4 (P4) mediante la técnica de microdisección9 describe aquí. Microdisección mediante visualización microscópica directa del tejido permite la disección específica de la cerebelosa EGL. Esto es necesario ya Nestin también se expresa por NSC en la sustancia blanca del cerebelo y por glía de Bergmann en la capa molecular 1,7,11,12 y era fundamental que estas células no se incluirán, como lo harían confundir el análisis. Las células aisladas de tejido microdissected se pueden utilizar inmediatamente para el análisis molecular o pueden ser cultivadas para otras aplicaciones.
Para ayudar en microdissecting específicamente el EGL y para purificar aún más los NEP, los ratones Math1-GFP (proteína verde fluorescente) se cruzaron con ratones Nestin-PPC (proteína fluorescente cian). El factor de transcripción Math1 se expresa específicamente por PNB y la expresión de GFP es claramente visible en el EGL 9,13. Ratones Nestin-PPC expresan una forma nuclear de la PPC y se pueden visualizar fácilmente en la capa molecular 9,14. En conjunto, las buenas prácticas agrarias y la expresión PPC crean límites para microdisección del EGL (ver Figura 1). NEP CFP-positivas se aislaron por FACS, después de la disociación enzimática de las EGLS disecados.
Actualmente, el método más bien utilizada para aislar las células de la EGL es centrifugación en gradiente de Percoll de todo el tejido cerebelar 15,16. Este método, sin embargo, no es capaz de excluir completamente las poblaciones de células nestina + de la capa molecular y la materia blanca y por lo tanto no se puede utilizar para el estudio de NEP. Microdisección de captura por láser, que utiliza la transferencia de energía de láser para eliminar las células de interés, es otro método usado para aislar las células específicas dentro de un tejido heterogéneo 17,18 pero las células capturadas sólo se pueden utilizar para la recuperación de ADN, ARN y proteínas y no son capaces de cultivarse.
Este protocolo proporciona una forma de aislar específicamente una población pura vida de los PIJ de la EGL.Esta técnica también se puede aplicar a diferentes tipos de tejidos que tienen ya sea la arquitectura anatómica reconocible o células marcadas fluorescentemente / regiones. Por lo tanto, la principal ventaja de la incorporación de esta nueva técnica de microdisección en los protocolos de aislamiento de células es que las células pueden ser aisladas de regiones específicas de tejido para eliminar la contaminación de los tejidos vecinos y las células se pueden recoger inmediatamente para su análisis o se cultivaron durante otras aplicaciones.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método de microdisección se describe aquí es el primer procedimiento capaz de aislar una población pura de células vivas para su uso en análisis moleculares y funcionales. Como se ha demostrado por Li et al. 9, NEP obtenidos por este método pueden ser cultivadas y se incorporan en diversos experimentos y debido a su alta pureza, también se pueden utilizar para el análisis de microarrays.
Es muy importante tomar el tiempo para alcanzar la competencia…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a James Oesterling para citometría de flujo asistencia. Esta investigación fue apoyada por una subvención del Instituto Nacional del Cáncer (R01-CA178380, ZY) y una donación de US Nacional Institutos de formación postdoctoral (5T32CA009035-37, LWY).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
Referências
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