Isolation von unterschiedlichen Zellpopulationen aus sich entwickelnden Kleinhirn durch Mikrodissektion
Summary
Nestin-exprimierenden Vorläuferzellen sind eine neu identifizierte Population von neuronalen Vorläuferzellen im sich entwickelnden Kleinhirn. Verwendung des Mikropräparationstechnik hier in Kombination mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung dargestellt, können diese Zellpopulation ohne Verunreinigung durch andere Kleinhirnregionen, gereinigt werden und kann für weitere Untersuchungen kultiviert werden.
Abstract
Mikrodissektion ist eine neuartige Technik, die spezifische Regionen eines Gewebe zu isolieren und Verunreinigungen zu beseitigen aus zellulären Quellen in benachbarten Bereichen können. Dieses Verfahren wurde in der Studie verwendet Nestin exprimieren Progenitoren (NEP), einem neu identifizierten Population von Zellen in der Klein externe Keimschicht (EGL). Verwendung Mikrodissektion in Kombination mit fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) wurde eine reine Population Nissen getrennt von herkömmlichen Granulat Neuron Vorstufen in EGL und von anderen kontaminierenden Nestin-exprimierenden Zellen im Kleinhirn gesammelt. Ohne Mikrodissektion würde funktionelle Analysen Nissen nicht mit der aktuellen Methoden zur Verfügung, wie Percoll-Gradienten-Zentrifugation und die Laser Mikrodissektion möglich. Diese Technik kann auch für die Verwendung mit verschiedenen Geweben, die entweder erkennbar Regionen oder fluoreszenzmarkierten Zellen enthalten eingesetzt werden. Am wichtigsten ist, ein wesentlicher Vorteil dieser microdissection Technik ist, dass isolierte Zellen leben und kann für weitere Experimente, die derzeit mit anderen beschriebenen Methoden nicht möglich ist kultiviert werden.
Introduction
Das Kleinhirn aus mehreren Zellschichten, die jeweils verschiedene Zelltypen umfassen. Während der Entwicklung der EGL enthält wuchernden Granulat Neuron Vorstufen (BSP), während die Molekularschicht und Purkinje-Schicht enthalten Bergmann Gliazellen und Neuronen Purkinje auf. Tief im Kleinhirn liegt die weiße Substanz, die neurale Stammzellen (NSCs) und Oligodendrozyten 1 enthält.
Sonic Hedgehog (Shh) spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Kleinhirnentwicklung und insbesondere fördert sie die Verbreitung von BSP über die Bindung an seinen Rezeptor Patched (PTC), einem negativen Regulator der Shh-Signal 2-4. Abweichende Aktivierung des Shh-Signal erzeugt Medulloblastom (MB), der häufigsten bösartigen Hirntumor bei Kindern 5,6.
PTC-Mutante MB transgenen Mausmodellen sind leistungsfähige Werkzeuge für die Untersuchung von MB und entwickeln Tumoren menschlichen MB 7,8 ähnelt. Mit diesenMäusen wurde festgestellt, dass BSP sind die Ursprungszelle für Hedgehog-Aktivität MB 7. Ferner, zusätzlich zu BSP, haben wir kürzlich eine einzigartige Population von neuronalen Vorläuferzellen in der EGL des Kleinhirns, die auch die Entwicklung hervorrufen können MB identifiziert. Diese Zellen exprimieren hohe Konzentrationen des Typs VI Intermediärfilament Protein, Nestin, und werden als NEP 9. NEP werden im tiefen Teil der EGL befindet und existieren nur in Neugeborenen vorübergehend Kleinhirnentwicklung. Sie sind auf der Körnerzelllinie als BSP verpflichtet, sondern sind verschieden, wie sie sind und nicht Ruhe Math1, eine gut etablierte Marker für herkömmliche BSP 10 auszudrücken. Darüber hinaus geben Anlass zu NEP MB effizienter als BSP nach Aktivierung des Shh-Signalweg 9, die sie zu einem neuen Ausgangspunkt für MB Tumorentstehung spielt.
Wir haben vorher isoliert NEPs aus der Kleinhirn EGL am postnatalen Tag 4 (P4) durch die Mikrodissektion Technikhier 9 beschrieben. Mikrodissektion über direkte mikroskopische Visualisierung des Gewebes ermöglicht spezifische Präparation der Kleinhirn EGL. Dies ist notwendig, da Nestin auch von NSC in der Klein weißen Substanz und von Bergmann Glia in der Molekularschicht 1,7,11,12 ausgedrückt und es war von entscheidender Bedeutung, dass diese Zellen nicht aufgenommen werden, da sie Analyse verwechseln. Zellen, die aus Gewebe isoliert microdissected kann sofort für die molekulare Analyse verwendet werden, oder sie kann für weitere Anwendungen kultiviert werden.
Auf staatliche Beihilfen, die speziell microdissecting die EGL und zur weiteren Reinigung Nissen, wurden Math1-GFP (green fluorescent protein)-Mäusen mit Nestin-GFP (cyan fluorescent protein)-Mäusen gekreuzt. Der Transkriptionsfaktor Math1 wird speziell durch BSP und GFP-Expression ausgedrückt ist in der EGL 9,13 deutlich sichtbar. Nestin-GFP-Mäuse exprimieren eine Kern Form von GFP und kann leicht in der Molekularschicht 9,14 visualisiert werden. Zusammen, GFP und GFP-Expression zu erstellen Grenzen für die Mikrodissektion der EGL (siehe Abbildung 1). GFP-positiven NEPs wurden dann durch FACS isoliert, nach enzymatischer Spaltung der beschäftigungspolitischen Leitlinien seziert.
Derzeit ist das Verfahren auch verwendet, um Zellen von der EGL isolieren Percoll-Gradienten-Zentrifugation von Vollkleinhirngewebe 15,16. Dieses Verfahren ist jedoch nicht Nestin +-Zellpopulationen aus der Molekularschicht und der weißen Substanz vollständig ausschließen und kann daher nicht für die Untersuchung der NEP verwendet werden. Laser Mikrodissektion, die die Übertragung von Laserenergie verwendet, um Zellen von Interesse zu entfernen, ist eine andere verwendet, um bestimmte Zellen in einer heterogenen Gewebe 17,18 isolieren, sondern gefangenen Zellen können nur zur Gewinnung von DNA, RNA und Protein verwendet werden und sind nicht Verfahren Lage, kultiviert werden.
Dieses Protokoll bietet eine Möglichkeit, gezielt isolieren eine lebendige, reine Population Nissen von der EGL.Diese Technik kann auch auf verschiedene Gewebearten, die entweder erkennbar anatomischen Architektur oder fluoreszenzmarkierten Zellen / Regionen angewendet werden. Daher ist der große Vorteil der Einbeziehung dieser neuartigen Mikropräparationsverfahren in Zellisolierungsprotokolle, die Zellen von bestimmten Gewebebereichen getrennt werden, zu beseitigen kontaminierenden benachbarte Gewebe und die Zellen können sofort für eine Analyse oder für andere Anwendungen kultiviert gesammelt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene Mikrodissektionsverfahren ist das erste Verfahren in der Lage, eine reine Population von lebenden Zellen für den Einsatz in der molekularen und funktionellen Analysen zu isolieren. Wie von Li et al. 9 gezeigt, NEP durch dieses Verfahren erhalten werden, können kultiviert werden und in verschiedenen Versuchen integriert werden und aufgrund ihrer hohen Reinheit kann auch für die Microarray-Analyse eingesetzt werden.
Es ist sehr wichtig, s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei James Oesterling für die Durchflusszytometrie Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der US-amerikanischen National Cancer Institute (R01-CA178380, ZY) und einer US-amerikanischen National Institute Postdoc-Stipendium (5T32CA009035-37, LWY) unterstützt.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
Referências
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