تصور الإيماس غير التحللي من<em> الأدعومية المستخفية</em> من الضامة الرقمية الخفيفة عن طريق الميكروسكوب
Summary
نحن تصف كيفية تصور macrophage- C. الأدعومية (CN) التفاعل في الوقت الحقيقي، مع التركيز بوجه خاص على عملية إيماس غير التحللي باستخدام المجهر الضوئي الرقمي. باستخدام هذه التقنية بشكل فردي الضامة المصابة يمكن دراستها للتأكد مختلف جوانب هذه الظاهرة.
Abstract
العديد من إصابة الضامة بواسطة الأدعومية المستخفية جوانب تم دراستها على نطاق واسع واضحة المعالم. ومع ذلك، واحدة تفاعل معين ليست مفهومة بشكل واضح هو إيماس غير التحللي. في هذه العملية، يتم الإفراج خلايا الخميرة في الفضاء خارج الخلية من خلال آلية غير مفهومة أن يترك كل من البلاعم و CN قابلة للحياة. هنا، نحن تصف كيفية متابعة عدد كبير من الضامة المصابة بشكل فردي لفترة العدوى 24 ساعة بواسطة المجهر-ساقطا الوقت. ويعيش الضامة المصابة في غرفة التدفئة مع جو CO 2 تعلق على المجهر التي توفر نفس الشروط حاضنة خلية ثقافة. يمكن المجهر الرقمي الحي تقديم معلومات عن التفاعلات الدينامية بين المضيف والممرض الذي لا يتوفر من الصور الثابتة. القدرة على تصور كل خلية مصابة يمكن أن توفر أدلة حول كيفية التعامل مع الضامة الالتهابات الفطرية، والعكس بالعكس. هذا ط تقنيةسا أداة قوية في دراسة القوى المحركة التي تقف وراء ظاهرة معقدة.
Introduction
مراحل العدوى الفطرية بين الخلايا الضامة بالمستخفيات وموثقة جيدا 1-3. بعد أن يتم تناولها من قبل خلايا الخميرة الضامة، قد تحدث مجموعة متنوعة من التفاعلات: لبلعم قد ليز الإفراج عن حمولتها الفطرية في الفضاء خارج الخلية، أو أنها يمكن السيطرة على العدوى عن طريق الحفاظ على خلايا الخميرة في كنف الغشاء الخلوي لها 4. ومع ذلك، منذ عدة سنوات وقد وصفت نتائج جديدة بشكل مستقل من قبل مجموعتين: إيماس غير التحللي، وهي العملية التي والبلاعم شطب بعض أو كافة الخلايا بالمستخفيات في البيئة المحيطة أو خلية المجاورة وكلا المضيف والممرض تبقى قابلة للحياة 5 -8. وقد حاول العديد من الدراسات لفهم الآليات الجزيئية وراء هذا التفاعل ولكن ما زلنا لم يكن لديك فهم كامل حول ما يدفع هذه الظاهرة.
القدرة على التقاط الصور في الوقت الحقيقي ومن ثم تحليلها لاحقا تصيب متعددةإد الضامة يسمح احد للإجابة على العديد من الأسئلة حول الخصائص الفيزيائية المحيطة إيماس غير التحللي في ما يخص التوقيت، والقدرة المكانية، وتغير في التشكل وحتى إجهاد الضامة خلال العدوى الفطرية. عن طريق السماح للخلايا أن يضم في بيئة غير قابلة للمقارنة إلى أن من حاضنة، يمكننا أن نلمح طبيعة الديناميكية لل-بلعم الفطرية التفاعلات الخلية. وقد استخدم الباحثون هذه التقنية لدراسة مختلف مكونات هذه العملية. وجاء دور يبلوع في هذه العملية واضحة باستخدام تلطيخ الفلورسنت والأكتين منع وكلاء 9، في حين أن مجموعة أخرى تستخدم هذه الطريقة لإظهار أن إيماس غير التحللي تم حظره في الخلايا والتي كان لها المياه والصرف الصحي nucleating المجالات البروتين حذف 10. كما تم التأكد من تأثير خلوى يشير في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر 11. ولا تقتصر هذه العملية على C. كما لوحظ الأدعومية كما مع المبيضات البيض، anotheص الممرض الفطرية التي لديها القدرة على إصابة 12 الضامة. هذه النتائج هي أمثلة على كيف أن هذا الأسلوب يمكن أن توفر ثروة من المعلومات لمنطقة نحن لا نعرف سوى القليل عنه.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا وصفناها الطريقة التي التفاعلات الفطرية البلاعم يمكن تسجيلها وتحليلها في الوقت الحقيقي على مدى فترة 24 ساعة. لدينا مختبر استخدمت هذا البروتوكول لدراسة العديد من الجوانب الزمنية للإيماس غير التحللي وستستمر في استخدام الوقت الحقيقي المجهر للتأكد من المكونات الشكل…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث في جزء من المعاهد الوطنية للصحة الجوائز 5T32AI07506، 5R01AI033774، 5R37AI033142، 5R01AI052733.
Materials
| Sabouraud Dextrose Agar | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud Dextrose Broth | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium(DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal Calf Serum ( FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES Buffer | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| Non-essential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | Toxic |
| 3003 Tissue Culture Petri Dishes | Fisher Scientific | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| Mouse IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | Non-commerical antibody produced in our lab | ||
| Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber | Zeiss | ||
Referências
- Voelz, K., May, R. C. Cryptococcal Interactions With the Host Immune System. Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).
- Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular microbiology. 15 (3), 403-411 (2012).
- Sabiiti, W., May, R. C. Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans. Future microbiology. 7 (11), 1297-1313 (2012).
- Bliska, J. B., Casadevall, A. Intracellular pathogenic bacteria and fungi — a case of convergent evolution. Nature Reviews Microbiology. 7, 165-171 (2008).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Cell-to-cell spread and massive vacuole formation after Cryptococcus neoformans infection of murine macrophages. BMC immunology. 8 (1), 16 (2007).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Direct cell-to-cell spread of a pathogenic yeast. BMC immunology. 8, 15 (2007).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcus neoformans phagocytosis by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2161-2165 (2006).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2156-2160 (2006).
- Johnston, S. A., May, R. C. The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans escapes macrophages by a phagosome emptying mechanism that is inhibited by Arp2/3 complex-mediated actin polymerisation. PLoS pathogens. 6 (8), (2010).
- Carnell, M., et al. Actin polymerization driven by WASH causes V-ATPase retrieval and vesicle neutralization before exocytosis. The Journal of cell biology. 193 (5), 831-839 (2011).
- Voelz, K., Lammas, D. A., May, R. C. Cytokine signaling regulates the outcome of intracellular macrophage parasitism by Cryptococcus neoformans. Infection and immunity. 77 (8), 3450-3457 (2009).
- Bain, M. J., Lewis, E. L., Okai, B., Quinn, J., Gow, A. R. N., Erwig, L. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal genetics and biology. 49 (9), 677-678 (2012).
