の非溶解性エキソサイトーシスの可視化<em>クリプトコッカス·ネオフォルマンス</em>デジタル光学顕微鏡を使用したマクロファージから
Summary
私たちは、マクロファージCを可視化する方法を説明しますネオフォルマンス （CN）デジタル光学顕微鏡を用いて非溶解性エキソサイトーシスの過程で特定の重点を置いて、リアルタイムで相互作用。この技術を用いて個別に感染したマクロファージは、この現象のさまざまな側面を確認するために研究することができる。
Abstract
クリプトコッカス·ネオフォルマンスによるマクロファージの感染の多くの側面が広く研究と明確に定義されています。しかし、明確に理解されていない一つの特定の相互作用は、非溶解性エキソサイトーシスである。このプロセスでは、酵母細胞は、マクロファージ及びCnの生存の両方を残すあまり理解機構によって細胞外空間に放出される。ここでは、時間の経過顕微鏡による24時間の感染期間ごとに個別に感染したマクロファージを大量に従う方法について説明します。感染したマクロファージは、細胞培養インキュベーター中と同じ条件を提供し、顕微鏡に取り付けられたCO 2雰囲気で加熱室に収納されている。ライブデジタル顕微鏡は、静止画像からは使用できませんホストと病原体との間の動的相互作用に関する情報を提供することができる。各感染細胞を可視化することができれば、マクロファージは真菌感染、およびその逆を処理する方法の手がかりを提供することができます。この技術iは複雑な現象の背後にある力学を研究する上でのsa強力なツール。
Introduction
クリプトコッカス細胞とマクロファージ間の真菌感染症のステージはよく1-3文書化されています。酵母細胞は、マクロファージによって摂取された後、相互作用の多様が発生することがあります。マクロファージは、細胞外空間に、その真菌負荷を解放する溶解もあれば、その細胞膜4の範囲内で酵母細胞を維持することによって感染を制御することができる。非溶解性エキソサイトーシス、マクロファージは、周囲の環境や隣接セルへクリプトコッカス細胞の一部またはすべてを抹消し、ホストおよび病原体の両方が5生存し続けるするプロセス：しかし、数年前に新しい結果が二つのグループによって独立して記述された-8。いくつかの研究は、この相互作用の背後にある分子メカニズムを理解しようとしましたが、私たちはまだこの現象をドライブかについての完全な理解していません。
リアルタイムで画像をキャプチャし、その後、複数の未感染を分析する能力マクロファージ編は、1つのタイミング、空間的な能力、真菌感染中のマクロファージの形態の変化、さらにはストレスに関して、非溶解性エキソサイトーシスを取り巻く物理的特性についての多くの質問に答えることができます。細胞がインキュベーターに匹敵する環境内に収容されるようにすることによって、私たちはマクロファージ真菌細胞相互作用の動的性質を垣間見ることができる。研究者は、このプロセスのさまざまなコンポーネントを研究するためにこの技術を使用している。別のグループは非溶解性エキソサイトーシスは、タンパク質ドメインの核WASH 10を削除して持っていた細胞内でブロックされたことを示すために、このメソッドを使用しながら、このプロセスにおけるファゴソームの役割は、蛍光染色およびアクチンブロッキング剤9を使用して明らかにされました。サイトカインシグナル伝達の効果もリアルタイム顕微鏡11を用いて確認された。このプロセスは、C.に限定されるものではないそれはまた、 カンジダ·アルビカンス、anotheで観察されたようネオフォルマンスマクロファージ12に感染する能力を有する真菌病原体rを。 これらの知見は、この方法は私達がそんなに少し知っ領域に豊富な情報を提供する方法の例です。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、真菌 – マクロファージ相互作用が24時間の期間にわたってリアルタイムで記録し、分析することができる方法を記載している。私たちの研究室では、非溶解性エキソサイトーシスの時間的な側面の多くを研究するために、このプロトコルを使用しており、このプロセスを囲む形態学的要素を確認するために、リアルタイムの顕微鏡を使用し続けます。
この技術…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、NIH賞5T32AI07506、5R01AI033774、5R37AI033142、5R01AI052733によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Sabouraud Dextrose Agar | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud Dextrose Broth | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium(DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal Calf Serum ( FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES Buffer | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| Non-essential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | Toxic |
| 3003 Tissue Culture Petri Dishes | Fisher Scientific | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| Mouse IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | Non-commerical antibody produced in our lab | ||
| Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber | Zeiss | ||
Referências
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