Visualizzazione non-litica Esocitosi di<em> Cryptococcus neoformans</em> Dai macrofagi utilizzando la luce Microscopia Digitale

Summary

Descriviamo come visualizzare macrofagi C. neoformans (Cn) interazioni in tempo reale, con particolare enfasi sul processo di esocitosi non-litica mediante microscopia ottica digitale. Utilizzando questa tecnica individuale macrofagi infetti può essere studiato per accertare i vari aspetti di questo fenomeno.

Abstract

Molti aspetti l'infezione di macrofagi da Cryptococcus neoformans sono stati ampiamente studiati e ben definito. Tuttavia, una particolare interazione che non è chiaramente compreso è esocitosi non-litico. In questo processo, le cellule di lievito vengono rilasciati nello spazio extracellulare con un meccanismo poco compreso che lascia entrambi i macrofagi e Cn praticabile. Qui, descriviamo come seguire un gran numero di macrofagi infettati singolarmente per un periodo di 24 ore l'infezione mediante microscopia-tempo trascorso. Macrofagi infetti sono alloggiati in una camera di riscaldamento con un atmosfera di CO ₂ collegato ad un microscopio che fornisce le stesse condizioni di un incubatore di coltura cellulare. Microscopio digitale diretta in grado di fornire informazioni sulle interazioni dinamiche tra un host e agente patogeno che non è disponibile da immagini statiche. Essere in grado di visualizzare ogni cellula infettata può fornire indizi su come i macrofagi gestire infezioni fungine, e viceversa. Questa tecnica isa potente strumento per studiare le dinamiche che stanno dietro un fenomeno complesso.

Introduction

Le fasi di una infezione fungina tra le cellule criptococco e macrofagi sono ben documentati ^1-3. Dopo cellule di lievito vengono ingeriti dai macrofagi, una varietà di interazioni possono verificarsi: il macrofago può lisare rilasciando il suo carico fungina nello spazio extracellulare, o potrebbe controllare l'infezione mantenendo le cellule di lievito entro i confini della sua membrana cellulare ^4. Tuttavia, alcuni anni fa un nuovo risultato è stato descritto indipendentemente da due gruppi: esocitosi non-litico, un processo in cui un macrofago cancellata alcune o tutte le celle criptococco nell'ambiente circostante o una cellula vicina e sia host e patogeno rimangono vitali ^{5 -8.} Diversi studi hanno cercato di comprendere i meccanismi molecolari alla base di questa interazione, ma abbiamo ancora non hanno una conoscenza completa su ciò che guida questo fenomeno.

La capacità di catturare immagini in tempo reale e successivamente analizzare infettare piùEd macrofagi permette di rispondere a molte domande sulle proprietà fisiche circostanti esocitosi non-litica per quanto riguarda i tempi, la capacità spaziale, il cambiamento nella morfologia e anche lo stress di macrofagi nel corso di una infezione fungina. Permettendo alle cellule di essere ospitati in un ambiente che è paragonabile a quello di un incubatore, possiamo intravedere la natura dinamica delle interazioni cellulari di macrofagi-fungine. I ricercatori hanno usato questa tecnica per studiare vari elementi di questo processo. Il ruolo del phagosome in questo processo è stato reso evidente con colorazione fluorescente e actina agenti di blocco ^9, mentre un altro gruppo ha usato questo metodo per dimostrare che esocitosi non-litica è stata bloccata in cellule che hanno avuto la WASH nucleazione domini proteici cancellato ^10. L'effetto di segnalazione delle citochine è stata anche determinata mediante microscopia in tempo reale ^11. Questo processo non è limitato a C. neoformans come è stato osservato anche con Candida albicans, another patogeno fungino che ha la capacità di infettare i macrofagi ^12. Questi risultati sono esempi di come questo metodo può fornire una serie di informazioni in un'area che sappiamo così poco.

Protocol

Tutto il lavoro animale è stato fatto in conformità con le normative e le linee guida dell'Istituto di studi sugli animali con Albert Einstein College of Medicine. 1. Crescita Condizioni di C. neoformans H99 (sierotipo A) Grow individuale C. neoformans (Cn) colonie su piastre di agar Sabouraud. Un giorno prima dell'esperimento, selezionare una colonia e inoculare 10 ml di brodo Sabouraud. Lasciare cultura a crescere durante la notte …

Representative Results

Le immagini che questa tecnica produce possono essere analizzati in una varietà di modi per raccogliere informazioni che circonda ciò che accade dopo che le cellule sono fagocitati C. neoformans. Come si vede nella figura 1, ci sono circa 100 i macrofagi che sono o infetto o non infetto. Ognuno di questi macrofagi dà allo spettatore l'opportunità di studiare le interazioni ospite-patogeno su un livello molto microscopico. Come le figure 2 e 3 mostrano, …

Discussion

Qui abbiamo descritto un metodo con cui le interazioni fungine-macrofagi possono essere registrati e analizzati in tempo reale per un periodo di 24 ore. Il nostro laboratorio ha utilizzato questo protocollo per studiare molti degli aspetti temporali della esocitosi non-litica e continuerà ad utilizzare la microscopia in tempo reale per accertare le componenti morfologiche che circondano questo processo.

Per questa tecnica per produrre risultati ottimali, particolare attenzione deve essere d…

Materials

Sabouraud Dextrose Agar	BD	DF0109-17-1
Sabouraud Dextrose Broth	BD	DF0382-17-9
Dubelcco's Modified Eagle's Medium(DMEM)	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal Calf Serum ( FCS)	Atlanta Biologicals	S12450
NCTC 109	Invitrogen	21340-039
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
HEPES Buffer	Corning Cellgro	25-060-Cl
Glutamax	Invitrogen	35050-061
Non-essential Amino Acids	Corning Cellgro	25-025-Cl
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023	Toxic
3003 Tissue Culture Petri Dishes	Fisher Scientific	08772E
CellStripper	Corning Cellgro	25-056-Cl
Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes	MatTek	P35GC-1.5-14-C
LPS	Sigma	L3137
Mouse IFN-g	Roche	NC 9222016
mAb 18B7	Non-commerical antibody produced in our lab
Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber	Zeiss