Abstract
Die Visualisierung der in voller Länge neuronalen Projektionen in Embryonen ist wesentlich für ein Verständnis, wie Säugetier neuronale Netze entwickeln zu gewinnen. Hier beschreiben wir eine Methode, um in situ zu markieren eine Teilmenge der Hinterwurzelganglien (DRG) Axon ihrer phänotypischen Eigenschaften beurteilen mit mehreren genetisch manipulierte Mauslinien. Die TrkA-positive Neurone nociceptor Neuronen, für die Übertragung von Schmerzsignalen gewidmet. Wir nutzen eine TrkA taulacZ Mauslinie, die Flugbahnen aller TrkA-positiven peripheren Axonen im intakten Mausembryo zu kennzeichnen. Wir züchten ferner den TrkA taulacZ Schnur auf eine Bax null Hintergrund, die im Wesentlichen aufhebt neuronale Apoptose, um wachstumsbedingte stellen unabhängig von möglichen Wirkungen von genetischen Manipulationen auf das neuronale Überleben zu beurteilen. Anschließend werden gentechnisch veränderte Mäuse von Interesse mit der TrkA Taul gezüchtetlacZ / Bax Nulllinie und sind dann bereit für die Studie unter Verwendung der hierin beschriebenen Techniken. Diese Präsentation enthält detaillierte Informationen über Maus Zuchtpläne, Genotypisierung bei der Dissektion, Gewebevorbereitung, Färbung und Clearing zur Visualisierung von voller Länge axonalen Bahnen ganz-mount Vorbereitung zu ermöglichen.
Introduction
Gründung der genauen neuronalen Netzen ist eine komplexe Entwicklungsprozess wesentlich für die Funktion des Nervensystems. Störung in diesem Verfahren führt zu neuronalen Funktionsstörungen, die in menschlichen neurologischen Erkrankungen 1-3 gebracht wurde. Um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Axon Wachstum und Ziel Innervation bei Säugetieren zu untersuchen, haben wir ein Protokoll, um die axonalen Bahnen der TrkA-exprimierenden sensorischen Neuronen mit einer Kombination von zwei genetisch veränderten Mauslinien zu visualisieren entwickelt.
TrkA ist ein Rezeptor für den Nervenwachstumsfaktor NGF und ein Funktionsmarker nozizeptiven sensorischen Neuronen 4. TrkA ist stark in nozizeptiven Neuronen während der frühen Entwicklung ausgedrückt und vermittelt NGF-abhängige Überleben von Neuronen, das Wachstum von Axonen, Verzweigung und Ziel Innervation 5-9. In TrkA taulacZ Mäusen wird die Wildtyp-TrkA-Gen von einem taulacZ Ausdruck c ersetztassette 10, derart, dass die axonale Morphologie putative TrkA-positive Neurone kann durch β-Gal (X-gal) Anfärben 11 visualisiert werden. Mit einem heterozygot TrkA taulacZ / WZ-Linie, können wir Faktoren, die zu regulieren oder zu stören die Entwicklung der sensorischen afferenten Projektionen in vivo kann zu untersuchen.
Außerdem ist TrkA Expression in homozygoten TrkA taulacZ / taulacZ Mäusen, die daher verwendet werden können, um das Wachstum der Axone zu fördern Mechanismen in Abwesenheit von NGF / TrkA Signalisierungs beurteilen abwesend. Seit nozizeptiven Neuronen hängt von NGF / TrkA Signalisierung nicht nur für das Wachstum von Axonen, sondern auch für das Überleben, setzen wir einen weiteren Mauslinie, ohne die pro-apoptotische Bax-Gens, die Apoptose in embryonalen DRG-Neuronen hemmen, retten sie vor Zelltod, die sonst ist in Abwesenheit von TrkA Signalisierungs beobachtet. Das Bax - / - Hintergrund 12 ermöglicht somit die Molekular Dissektion von Signalwegen, die speziell beeinflussen Axonwachstum 7-9,13-15. In TrkA - / -: Bax - / - Mäuse, DRG-Neuronen überleben, aber sensorischen afferenten Innervation der Haut vollständig abgeschafft 14,15. Wir können selektiv aktiviert Signalwege auf ihre jeweiligen Beiträge zur Entwicklung von Axon Projektionen zu bestimmen. Der Nutzen dieser Methode ist, dass sie die Beurteilung der Änderungen im Wachstum der Nervenfasern Phänotypen, wenn verschiedene genetische Veränderungen werden auf die TrkA taulacZ / taulacZ gezüchtet: Bax - / - oder TrkA taulacZ / WT: Bax - / - Hintergründe.
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Protocol
Hinweis: Alle Verfahren mit dem NIH Leitfaden für die Benutzung und Pflege von Labortieren entsprechen. Das Tier Protokoll wurde von der IACUC am Weill Cornell Medical College zugelassen.
1. Gewebepräparation
- Euthanize timed-Schwangerschaft Frauen durch Genickbruch 15. Präparieren embryonalen E16 - E18 Embryonen aus timed-Schwangerschaft Weibchen und Ort Embryonen einzeln in die Wells einer 6-Well-Platte, mit kalter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gefüllt.
- Spülen Embryonen in kaltem PBS.
- Entfernen eines kleinen Teils der Amnionmembran des Embryos und in eine vorbereitete Proteinase K-Lösung für die nachfolgende Genotypisierung. Alternativ, wenn die Amnionmembran verloren geht, nehmen Sie einen kleinen Teil der Spitze des Embryos Schwanz und ihn in Proteinase K-Lösung
- Poke Löcher in die Haut rund um den Embryo mit Insektenstifte (mindestens 100 pro Seite).
- Entfernen PBS und langsam frisch 2% Paraformaldehyd (PFA),pH 7,4, zum Brunnen.
- Schütteln für 2 h bei 4 ° C.
- Embryonen zweimal Spülen in PBS und lagern in PBS bei 4 ° C bis zur Färbung.
2. Genotypisierung
- Tauchen Amnionmembranen oder Embryo Schwänze in Proteinase K Mischung gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Inkubiere bei 56 ° C für 10 min.
- Extrahieren DNA unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen DNA-Reinigungskits.
- Nehmen 0,5 ul der gesamten 200 ul gereinigte genomische DNA-Lösung, kombiniert mit 0,5 & mgr; l von jeder der genspezifischen Sense- und Antisense-Primer (10 & mgr; M), 2 & mgr; l dNTP-Mix (2,5 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP) , 0,2 ul Taq-Polymerase (5 U / ul) und 2 ul PCR-Puffer (10x), fügen H 2 O auf ein Gesamtvolumen von 20 ul.
HINWEIS: Die Primersequenzen sind wie folgt (Tabelle 1):
TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R: GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG; PCR fragment Länge: 400 Basenpaare (bp).
Bax: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA TG, NeoR: CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG; PCR-Fragment Längen: Wildtyp, 304 bp; Bax null, 507 bp.
TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; PCR-Fragment-Längen: 360 bp. - Führen einer PCR mit dem folgenden Programm für TrkA: Schritt 1: 1 min bei 95 ° C, Stufe 2: 10 sec bei 95 ° C, Stufe 3: 20 sec bei 68 ° C, Stufe 4: 30 sec bei 72 ° C. Wiederholen Sie die Schritte 2-4 für 40 Zyklen.
- Für LacZ und Bax, führen eine PCR nach folgendem Programm: Schritt 1: 1 min bei 95 ° C, Stufe 2: 10 sec bei 95 ° C, Stufe 3: 1 min bei 54 ° C, Schritt 4: 1 min bei 72 ° C, wiederholen Sie die Schritte 2-4 für 35 Zyklen.
- Run PCR-Proben auf einem 2% Agarosegel bei 100 V in 1x Tris-Acetat-EDTA-Puffer für 20 min mit einer Spur-DNA-Leiter, um Fragmentlängen abzuschätzen.
- Analysieren Embryonen für die Anwesenheit von Wildtyp-TrkA, TRKA-tauLacZ und Bax Nullallele. Die Genotypen der experimentellen Embryonen TrkA taulacZ / WT: Bax - / - und TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - in Abhängigkeit von den experimentellen Fragen. Embryonen ohne die tauLacZ Reporter negativ für axonalen Färbung sein und kann daher dazu dienen als Negativkontrollen, um den Färbeprozess zu kalibrieren.
3. Embryo Färbung
- Verwenden eines kommerziellen Kits zur LacZ-Färbung mit einigen Änderungen, wie unten in den Abschnitten 3.2 - 3.8. Hier verwenden Sie die Millipore-Kit.
- Tauchen Embryonen in Puffer A für mindestens 1 h bei Raumtemperatur vorsichtig schütteln.
- Direkt tauchen Embryonen in Puffer B für mindestens 15 min bei Raumtemperatur vorsichtig schütteln.
- Während Embryonen werden in Puffer A / B, vorwärmen Tissue Basislösung bei 37 ° C. Verwenden Sie 5 ml Gewebebasislösung pro Embryo.
- Während Embryonen in Puffer A / B, bereiten Sie frisches 5-bromo- 4- Chlor- 3- indolyl α-D-galactopyranosid (X-gal) bei einer Konzentration von 40 mg / ml in 100% Dimethylsulfoxid (DMSO).
- Verdünne X-gal in die vorgewärmte Tissue Basenlösung mit einer Konzentration von 1 mg / ml und 5 ml X-gal / Tissue Basismischung auf eine Glasszintillationsröhrchen.
- Übertragen Embryonen auf ein Glasszintillationsröhrchen enthaltende X-gal / Tissue Basismischung. Seal Deckel mit Parafilm und bei 37 ° C über Nacht, Prüfen auf Vorhandensein von Bläue.
- Postfix Embryonen mit frischen 4% PFA, pH-Wert 7,4. Schütteln 4 Stunden bei 4 ° C.
- Embryonen zweimal Spülen in kaltem PBS.
4. Tissue Dehydration und Clearing
- Ort Embryonen in 50% Methanol / 50% PBS Gemisch 30 min bei Raumtemperatur in den Glasphiolen Schütteln.
- Weiterhin in 75% Methanol / 25% PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur dehydriert, in Glasfläschchen schüttelnd.
- Weiterhin in 90% entwässern Methanol / 10% PBS 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in Glasfläschchen schüttelnd.
- Weiter in 100% Methanol für 30 min (2x) bei Raumtemperatur zu entwässern, in Glasfläschchen schüttelnd.
- Während Embryonen Dehydratisierung, bereiten ein 1: 1 (v: v) Mischung aus Benzoylperoxid Alkohol und Benzoylbenzoat.
HINWEIS: Benzoyl Alkohol und Benzoylbenzoat ist giftig. - Tauchen Embryonen in 1: 1 (v: v) Mischung aus 100% Methanol: 100% BABB für 15 min. Benutzen Glas nur, weil die BABB wird Kunststoff auflösen.
- Tauchen Embryonen in 100% BABB völlig klar, dass die Gewebe und X-Gal-Färbung in der gelöscht Embryo sichtbar zu machen.
HINWEIS: Bild so schnell wie möglich, weil die X-gal-Färbung mit der Zeit verblassen.
5. Ganze Berge Imaging
- Stabilisierung des Embryos, in 100% BABB getaucht, an den entsprechenden Winkel für die Fotografie mit Metallzangen. Beleuchten Sie mit einer Kombination aus bis-Licht und unter Lichtlichtquellen.
- Erwerben Sie Bilder mit einem Binokularmit einer Digitalkamera ausgestattet. Nehmen Sie mehrere Hellfeldaufnahmen an fünf aufeinander folgenden Brennebenen 0,5 mm, die entlang der Z-Achse. Belichtungszeiten und Blendenstufen können nach Beleuchtung und Kameradaten variieren und müssen für jedes Setup optimiert werden.
- Verwenden Sie Standard-Bildverarbeitungs-Software, um Overlay-Bilder verarbeiten und Fotomontagen.
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Representative Results
Die Genotypen von TrkA WT / taulacZ: Bax - / - und TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - Embryonen können eindeutig durch Standard-PCR Genotypisierung bestimmt werden (Abbildung 1). X-Gal-Färbung zeigt detaillierte periphere axonale Verzweigungen subkutan in konventionell gefärbten Embryonen (Figuren 2, 3a), und während der Embryo nach Gewebe Clearing (3b, 4).
/ - - Linie mit Mäusen, die konstitutiv Kinase-aktivierte B-RAF (V600E) Mutation (LSL-kaBraf 16) unter der Kontrolle des Neuron-spezifische Nestin-Promotor 17, zu erhalten LSL- Bax: Wir haben die TrkA WT / taulacZ gezüchtet kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - Mäusen. In diesen Embryonen, die vollständig fehlt TrkA-Signalisierung, die Morphologie nociceptor Umfangsvorsprünge dennoch entwickelt fast normal (Figur 4). Diese zeigen,sa entscheidende Funktion für B-RAF-Signalisierung in Umfangs Axonwachstum, und zeigt auch, dass die Überlebensrate und Axon-Wachstum fördernde Funktionen TrkA Signalisierung getrennt werden können, wobei die Bax - / - genetischen Hintergrund als Ersatz für den Verlust von TrkA abhängigen Überlebenssignalgebung .
Abbildung 1: Genotypisierung von den transgenen Mäusen Vertreter Agarosegel Bilder.. Beispiel 1: TrkA WT / taulacZ: Bax WT / -, Probe 2: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -, Probe 3: TrkA WT / taulacZ: Bax - / -.
Abbildung 2: E18.5 TrkA WT / taulacZ Maus mit X-Gal gefärbt Axon Projektionen Trigeminalganglien im Rumpf und HEA.d sind in einer ungeklärten Embryo gezeigt. Maßstab: 1 mm.
Fig. 3: E18.5 TrkA WT / taulacZ Maus mit X-gal (A) gefärbt vor und (B) nach dem Löschen mit BABB Vorsprünge von DRGs Mitte Torso dargestellt. Maßstab: 2 mm.
Figur 4: Eine E16.5 LSL-kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -.: Nestin-Cre Mausembryo mit X-gal gefärbt und mit BABB kaBraf gelöscht eine Kinase aktiviert B-RAF-Kinase-Proteins kodiert, B-RAF V600E. Die Expression von KAB-RAF in DRG-Neuronen führte in voller Länge, in der Nähe von normalen Axon Erweiterung in der Abwesenheit von TrkA-Signalisierung. Maßstab: 1 mm. Weitere Bilder mit Steuerelementen finden ref. 15, Abbildung2.
| Primer für die PCR-Genotypisierung verwendet | ||
| 1 | TrkA | DNA-Fragment, Größe: 400 bp |
| TrkA_F | GCG GGC GCC GCC GCG ATG | |
| TrkA_R | GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG | |
| 2 | Bax | DNA-Fragment, Größe: 304 bp (Wildtyp), 507 bp (Bax null) |
| In5R | GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG | |
| Ex5F | TGA TCA GAA CCA TCA TG | |
| NeoR | CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG | |
| 3 | TauLacZ | DNA-Fragment, Größe: 360 bp |
| lacZup | ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA | |
| lacZdown | ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G | |
Tabelle 1: Primer für die PCR-Genotypisierung eingesetzt.
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Discussion
Die oben beschriebene X-gal Färbeverfahren embryonaler TrkA taulacZ Mäusen erlaubt die schnelle und präzise Visualisierung Fern Axon in der intakten Fest Embryo. Aufgrund der Bax null Hintergrund diese Mäuse ermöglichen die Untersuchung von Signalmechanismen, die sowohl Axon Wachstum und Überleben von Neuronen beitragen können. Paarung mit transgenen oder Knockout-Mäuse von Interesse ermöglicht die umfassende Beurteilung der axonalen Phänotypen und kann als nützlicher Leitfaden für zukünftige Experimente dienen dazu, das Wachstum von Axonen Signalisierung noch gezielter zu untersuchen. Eine große Herausforderung für die in vivo Axonwachstum Studien ist die Zeit, um Gewebe zu bereiten Sektionen und Auswertung der komplexen Phänotypen der wachsenden Axone, die in mehrfacher Hinsicht von einem genetischen Manipulation betroffen sein können. Die TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - Linie ermöglicht die Evaluierung der Auswirkungen, die ein Genvon Zinsen auf peripheren Nozizeptoren Axon Entwicklung.
Die Technik basiert auf der Visualisierung nociceptor axonalen Trajektorien, die normalerweise TrkA während der frühen Entwicklungsstadien auszudrücken wäre begrenzt. Neben den peripheren Nozizeptoren, kann es möglich sein, sympathische und basales Vorderhirn cholinergen Vorsprünge visualisieren; allerdings würde dies spezifische Optimierung der Färbetechniken erforderlich
Tissue Clearing ist ein wichtiger Schritt des hier beschriebenen Protokoll. Es ermöglicht detaillierte Bewertung der tiefer liegenden Projektionen ganz-mount Präparate und damit das Potenzial Identifizierung von unterschiedlichen Phänotypen. Fluorescent Reporter wie tdTomato oder GFP-Reporter 18,19 kann visuelle Klarheit unter bestimmten Bedingungen bieten, aber es ist schwierig, Bild ganze-mount zu erwerben, da wir festgestellt, dass im Gegensatz zu der X-gal-Färbung, verblassen Fluoreszenzsignale wesentlichen während das Gewebe Clearing-Verfahren. DilFärbung ist auch weithin für Axon Kennzeichnung 20 verwendet; Unzulänglichkeiten sind, dass sie nicht gezielt eine bestimmte Unterart von Axonen Marker wie Nozizeptors Fasern hier, und es ist schwierig, vollständig zu kennzeichnen langen Bahnen in der Peripherie.
Zusammenfassend bieten wir ein Protokoll, das eine Kombination von zwei genetisch veränderten Mauslinien verwendet, um Routine-Visualisierung der volle Lauben von nozizeptiven Axone im Maus-Embryo zu ermöglichen.
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Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Louis Reichardt für die TrkA taulacZ Mäusen und Dr. Annette Markus für aufschlussreiche Diskussionen und Anregungen. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Startup-Burke-Stiftung sowie Whitehall-Stiftung Forschungsstipendium 2010-08-61, ein Forschungsstipendium von Wings for Life Foundation (WFL-US-028/14) unterstützt wird, gewähren ZB1-1102-1 von der Christopher & Dana Reeve Foundation, und Zuschüsse 1R01EY022409 und 3R01EY022409-01S1 vom National Eye Institute, zu JZ. KJO ist ein Goldsmith Kerl.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| PBS | Life Tech | 10010-023 | |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B | |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B | |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 | |
| Incubator | Labline | Model 120 | |
| Insect pins | FST | 26000-30 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 6-well dish | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Primers | IDT | custom DNA primers | |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 | |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A | |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A | |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 | |
| Dissecting microscope | Leica | M205A | |
| Camera | Leica | DFC310FX | |
| Ring light | Leica | MEB110 | |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
References
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