सिगरेट के धुएं में उजागर चूहे में फेफड़े के वातस्फीति और लघु श्वासनली remodeling के स्वचालित माप

Summary

The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.

Abstract

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020⁽¹⁾. Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs⁽²⁾. However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD^(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients⁽⁶⁾, but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill’s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson’s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.

Introduction

कोई मॉडल पूरी तरह से मानव रोग ⁽²⁾ के सभी सुविधाओं की नकल कर सकते क्योंकि सीओपीडी अध्ययन करने के लिए पशु मॉडल के उपयोग चुनौती दे रहा है। सबसे जांचकर्ताओं क्योंकि उनके फेफड़े के शरीर क्रिया विज्ञान, विकृति विज्ञान, जेनेटिक्स, और चयापचयों में चूहों और इंसानों के बीच समानता की सीओपीडी मॉडल करने के लिए चूहों का उपयोग करें। इसके अलावा, चूहों का अध्ययन करने के लिए अपेक्षाकृत सस्ती हैं, और वातस्फीति और छोटे airway के remodeling के दोनों सीएस जोखिम ^(5,7-9) के 6 महीने के भीतर विकसित करना।

सिगरेट के धुएं प्रेरित सीओपीडी: कई तरीकों चूहों में सीओपीडी के लिए प्रेरित कर सकते हैं। सबसे शोधकर्ताओं मानव सीओपीडी के लिए मुख्य etiologic कारक है जो सीएस, चूहों को बेनकाब। 6 महीने के लिए सीएस जोखिम वातस्फीति और चूहों में छोटे airway के remodeling के (एसएआर) के विकास का कारण बनता है, लेकिन प्रेरित किया जाता है कि बीमारी की गंभीरता का अध्ययन murine तनाव पर निर्भर करता है। AKR / जम्मू चूहों extremel रहे हैं, जबकि उदाहरण के लिए, NZWLacZ चूहों सीएस प्रेरित वातस्फीति के विकास के लिए प्रतिरोधी रहे हैंसंवेदनशील वाई ^(10)। सबसे जांचकर्ताओं के रूप में कई जीन-लक्षित चूहों इस तनाव में उपलब्ध हैं सीएस लोगों तक पहुंचाने के मॉडल में C57BL 6 / तनाव चूहों का अध्ययन। सीएस जोखिम, वातस्फीति और छोटे airway के फाइब्रोसिस के 6 महीने बाद जंगली प्रकार में विकसित (डब्ल्यूटी) C57BL / 6 चूहों, और दोनों के घावों गंभीरता ^(5,10) में अपेक्षाकृत हल्के होते हैं। नाक-केवल और पूरे शरीर जोखिम: शोधकर्ताओं ने सीएस लोगों तक पहुंचाने के दो प्रकार का उपयोग करें। 1) यह एक और अधिक श्रम प्रधान विधि है;: नाक-केवल जोखिम तकनीक के बड़े नुकसान कर रहे हैं कि और 2) चूहों जानवर ⁽¹¹⁾ में एक तनाव प्रतिक्रिया और अतिताप पैदा कर सकते हैं, जो छोटे कक्षों में रोका जाना है। (इस के साथ साथ वर्णित) पूरे शरीर जोखिम के प्रमुख नुकसान है कि वे अपने फर साफ जब जानवरों निकोटीन और टार उत्पादों (के रूप में अच्छी तरह से श्वास के रूप में) निगलना कर सकते हैं। पूरे शरीर सीएस के संपर्क में चूहे भी कम carboxyhemoglobin स्तर है और नाक-केवल सीएस ⁽¹²⁾ के संपर्क में जानवर के साथ तुलना में जब शरीर के वजन के नुकसान को कम किया।

<p claएस एस = "jove_content"> फेफड़े के कार्य परीक्षण (PFTS): फेफड़ों के अनुपालन और elastance के उपाय आमतौर पर C57BL 6 / जंगली प्रकार में इसी तरह के हैं (डब्ल्यूटी) की वजह से जब इस विकसित करता है कि अपेक्षाकृत हल्के वातस्फीति के लिए 6 महीने के लिए हवा या सीएस के संपर्क में चूहों तनाव सीएस ⁽¹⁰⁾ के संपर्क में है। Emphysematous विनाश और अधिक गंभीर है हालांकि, जब फेफड़ों के अनुपालन और दबाव मात्रा (पीवी) में छोड़ दिया पारियों में बढ़ जाती है छोरों पता लगाया जा सकता प्रवाह। उत्तरार्द्ध C57BL 6 / WT चूहों की तुलना में एक अधिक गंभीर वातस्फीति प्रकार है कि सीएस उजागर C57BL 6 / तनाव जीन-लक्षित चूहों में, सीएस के प्रभाव ⁽¹⁰⁾ के लिए अतिसंवेदनशील हैं कि murine उपभेदों में, उदाहरण के लिए, मनाया जा सकता है या सीएस के प्रभाव ⁽¹⁴⁾ के लिए अतिसंवेदनशील उन्हें प्रस्तुत करना है कि पर्यावरण परिवर्तन के अधीन सीएस उजागर चूहों में ^(13)। इस प्रोटोकॉल के ऊतकों में फेफड़ों की लोचदार हटना (quasistatic फेफड़ों के अनुपालन में बढ़ जाती है [सीएसटी] में कटौती और कटौती को मापने के लिए एक छोटा सा जानवर वेंटीलेटर का उपयोग करता हैelastance [एच]), पी.वी. प्रवाह छोरों, और anesthetized चूहों ^(15,16) में airway और ऊतक प्रतिरोध में परिवर्तन।

फेफड़े के वातस्फीति के उपाय: इसके वितरण स्थानिक विषम है क्योंकि सीएस उजागर C56BL / 6 तनाव चूहों में वातस्फीति विकास का विश्लेषण चुनौतीपूर्ण है। कई अलग अलग तरीकों चूहों में हवाई क्षेत्र इज़ाफ़ा यों। इस्तेमाल पहली विधि ⁽¹⁷⁾ मतलब रैखिक अवरोधन (एल _एम) था। हालांकि, एल _एम विधि (फेफड़ों के सभी वर्गों के बेतरतीब ढंग से जांचा जाता है, जब तक) की बीमारी है और इसलिए विश्लेषण में पर्यवेक्षक पूर्वाग्रह परिचय हो सकता है इसके उपयोग की विविधता पर कब्जा नहीं कर सकता है, जो एक धीमी, मैनुअल प्रक्रिया है। विनाशकारी सूचकांक [डि, ^(18)] भी एक hematoxylin और eosin दाग फेफड़ों खंड की एक मुद्रित डिजीटल छवि पर रखा 50 समान रूप से वितरित अंक के साथ एक पारदर्शी चादर का उपयोग कर हवाई क्षेत्र इज़ाफ़ा quantifies। पीआई विधि स्कोर एक बिंदु एसी आसपास के क्षेत्र मेंहद के मुताबिक, जो इस क्षेत्र के भीतर वायुकोशीय नलिकाओं और वायुकोशीय दीवारों को नष्ट कर रहे हैं। डि विधि के मुख्य नुकसान यह समय लेने वाली और अन्य तरीकों ^(19,20) की तुलना में ज्यादा सटीक नहीं है।

इस प्रोटोकॉल के उपायों गिल की दाग ​​के साथ दाग आयल एम्बेडेड फेफड़ों वर्गों पर वायुकोशीय तार की लंबाई और वायुकोशीय क्षेत्र से मतलब है। Morphometry सॉफ्टवेयर द्विआधारी छवियों फेफड़ों वर्गों की छवियों धर्मान्तरित (जिसमें ऊतक सफेद है और हवाई क्षेत्र काला है), और फिर क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर लाइनों (chords के) की एक समान ग्रिड superimposes और सॉफ्टवेयर फिर से पहचान क्षेत्रों के भीतर प्रत्येक तार की लंबाई quantifies हवाई क्षेत्र के रूप में सॉफ्टवेयर। इस विधि का प्रयोग, यह एक मानकीकृत और अपेक्षाकृत स्वचालित ढंग ⁽²¹⁾ में फेफड़ों के सभी भागों में alveoli के आकार को मापने के लिए संभव है।

लघु airway के remodeling के (एसएआर): ईसीएम प्रोटीन की वृद्धि बयान (विशेष रूप से interstitiaछोटे एयरवेज के आसपास एल कोलेजन) सीएस उजागर जानवरों में पाया जाता है और रुकावट airflow के योगदान देता है। शोधकर्ताओं वातस्फीति विकास ⁽²²⁾ के रूप में अक्सर के रूप में सीओपीडी के पशु मॉडल में खोज एवं बचाव का अध्ययन नहीं करते। सीएस उजागर चूहों में खोज एवं बचाव यों, इस प्रोटोकॉल छोटे एयरवेज आयल एम्बेडेड फेफड़ों वर्गों में (एयरवेज 300 और 899 मीटर के बीच एक मतलब व्यास वाले) के आसपास जमा है कि ईसीएम प्रोटीन की परत की मोटाई मापने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है मैसन का Trichrome दाग के साथ दाग।

Protocol

प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए 25 सप्ताह ~ लेता है। प्रोटोकॉल 24 सप्ताह के लिए हवा या धूम्रपान करने के लिए चूहों अवगत कराया। धुआं जोखिम के अंत में, प्रोटोकॉल उपायों फेफड़े के चूहों में समारोह, और फेफड़े, एक निश्चित ?…

Representative Results

इस प्रोटोकॉल सीएस के लिए चूहों के पूरे शरीर प्रदर्शन के साथ शुरू होता है। पर्याप्त निरीक्षण और डिवाइस और TPM की निगरानी के रखरखाव लगातार धुआं जोखिम (चित्रा 1) सुनिश्चित गिना जाता है। शोधकर्ता मुद्?…

Discussion

Most researcher use mice to model the main chronic lung pathologies and abnormal lung physiology in COPD (airspace enlargement, SAR, and increases in lung compliance) present in the human disease. A comprehensive approach to assess the effect of molecules of interest on both emphysema development and SAR is needed in mice in order to comprehensively assess the activities of molecules of interest in these chronic disease processes.

There are several critical steps in this protocol. First, dur…

Materials

Whole-body smoke exposure device	Teague Enterprise	TE-10z	Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice
Research Cigarette	University of Kentucky	3R4F reference cigarettes
Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm	Pall Corporation	7219	For measurement of TPMs
25 mm filter holder	Pall Corporation
Filter sampler	Intermatic	Metal T100
Gas meter	AEM	Gas meters G1.6; G2.5; G4
Tracheal Cannula for mouse 18 gauge	Labinvention		Analysis of pulmonary function
Mechanical ventilator	Scireq	FlexiVent
Gill's hematoxylin solution	Sigma-Aldrich	GSH316	For Gill staining, work under a fume hood
Hematoxylin solution, Harris modified	Sigma-Aldrich	HHS16
Cytoseal-60	Thermo Scientific	8310-16
Micro-Slide-Field-Finder	Andwin Scientific INC	50-949-582	For analysis of emphysema
Scion Image Program	Scion Corporation
Mason's trichrome stain	Sigma-Aldrich	HT15	For analysis of small airway fibrosis
MetaMorp Offline version 7.0	Molecullar Devices LLC	31032