Medición automática de enfisema pulmonar y la pequeña vía aérea Remodelación de cigarrillos sin humo Ratones expuestos
Summary
The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.
Abstract
COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill’s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson’s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.
Introduction
El uso de modelos animales para estudiar la EPOC es un reto porque ningún modelo puede replicar perfectamente todas las características de la enfermedad humana (2). La mayoría de los investigadores utilizan ratones para modelar la EPOC debido a las similitudes entre los ratones y los seres humanos en sus pulmonares fisiología, patología, genética y metabolitos. Además, los ratones son relativamente baratos para estudiar, y tanto el enfisema y la remodelación de la vía aérea pequeña desarrollan dentro de los 6 meses de exposición CS (5,7-9).
Cigarrillos EPOC inducida por el humo: Varios métodos pueden inducir la EPOC en ratones. La mayoría de los investigadores exponen ratones para CS, que es el principal factor etiológico para la EPOC humano. La exposición CS durante 6 meses causa el desarrollo de enfisema y la remodelación de la vía aérea pequeña (SAR) en ratones, pero la gravedad de la enfermedad que es inducida varía dependiendo de la cepa murina estudiado. Por ejemplo, los ratones NZWLacZ son resistentes al desarrollo de enfisema inducido-CS mientras que AKR / J ratones son extremely sensible (10). La mayoría de los investigadores estudian C57BL / 6 ratones de la cepa en el modelo de exposición CS como muchos ratones de genes dirigidos están disponibles en esta cepa. Después de 6 meses de exposición CS, el enfisema y la fibrosis de la pequeña vía aérea a desarrollar en el tipo salvaje (WT) C57BL / 6 ratones, y ambas lesiones son relativamente leves en gravedad (5,10). Los investigadores utilizan dos tipos de exposición CS: sólo de la nariz y de todo el cuerpo exposiciones. Las principales desventajas de la única nariz técnica de exposición son que: 1) es un método más mano de obra; y 2) los ratones tienen que ser contenido en pequeñas cámaras que pueden inducir una respuesta de estrés y la hipertermia en los animales (11). La principal desventaja de exposición de cuerpo entero (que se describe en la presente memoria) es que los animales pueden ingerir (así como inhalar) nicotina y alquitrán productos cuando limpian su piel. Los ratones expuestos a todo el cuerpo CS también tienen niveles de carboxihemoglobina inferiores y pérdida de peso corporal reducido en comparación con los animales expuestos a la nariz de sólo CS (12).
<p class = "jove_content"> prueba de función pulmonar (PFT): Las medidas de la distensibilidad pulmonar y elastancia suelen ser similares en ratones C57BL / 6 de tipo salvaje (WT) ratones expuestos al aire o CS durante 6 meses debido al enfisema relativamente leve que se desarrolla cuando este cepa se expone a CS (10). Sin embargo, cuando la destrucción enfisematosa es más grave, el aumento de la distensibilidad pulmonar y desplazamientos a la izquierda en la presión-volumen (PV) fluyen bucles pueden ser detectados. Este último se puede observar, por ejemplo, en las cepas murinas que son más susceptibles a los efectos de CS (10), en / 6 ratones de cepas de genes dirigidos expuestas-CS C57BL que tienen un tipo enfisema más severo que C57BL / 6 ratones WT (13), o en ratones expuestos-CS sometidos a cambios ambientales que las hacen más susceptibles a los efectos de CS (14). Este protocolo utiliza un pequeño ventilador para animales para medir la reducción en el retroceso elástico del pulmón (aumento de la distensibilidad pulmonar cuasiestático [Cst] y las reducciones en el tejidoelastancia [H]), los bucles de flujo de PV, y los cambios en la resistencia de las vías respiratorias y el tejido en ratones anestesiados (15,16).Medidas de enfisema pulmonar: Análisis del enfisema en expuestos al CS C56BL / 6 ratones cepa es un reto, ya que su distribución es espacialmente heterogénea. Varios métodos diferentes cuantificar ampliación del espacio aéreo en los ratones. El primer método utilizado fue la media de intercepción lineal (L m) (17). Sin embargo, el método L m es un proceso lento, manual que puede no captar la heterogeneidad de la enfermedad (a menos que todas las secciones del pulmón se seleccionan aleatoriamente muestras) y su uso por lo tanto, puede introducir un sesgo de observador en el análisis. El índice de destrucción [DI, (18)] también cuantifica ampliación del espacio aéreo utilizando una lámina transparente con 50 puntos igualmente distribuidos colocados sobre una imagen digitalizada impresa de un hematoxilina y eosina sección de pulmón manchados. El método PI puntajes de la zona que rodea a cada punto de acacuerdo con el grado en que se destruyen los conductos alveolares y paredes alveolares dentro de esta área. La principal desventaja del método de DI es que es mucho tiempo y no más exacto que otros métodos (19,20).
Este protocolo mide significan longitud de la cuerda alveolar y zona alveolar de pulmón secciones incluidas en parafina teñidos con tinción de Gill. Software Morfometría convierte las imágenes de secciones de pulmón a imágenes binarias (en la que el tejido es de color blanco y el espacio aéreo es negro), y luego se superpone una rejilla uniforme de líneas horizontales y verticales (acordes) y el software entonces cuantifica la duración de cada acorde dentro de las áreas identificadas por software como espacio aéreo. Usando este método, es posible medir el tamaño de los alvéolos en todas las partes del pulmón de una manera estandarizada y relativamente automatizado (21).
La remodelación de la vía aérea pequeña (SAR): El aumento de la deposición de proteínas ECM (especialmente intersticiosl colágenos) alrededor de las pequeñas vías aéreas se produce en los animales expuestos al CS y contribuye a la obstrucción al flujo aéreo. Los investigadores no estudian SAR en modelos animales de EPOC con tanta frecuencia como el desarrollo de enfisema (22). Para cuantificar SAR en ratones expuestos-CS, este protocolo utiliza el software de análisis de imagen para medir el grosor de la capa de proteínas ECM que se deposita alrededor de las pequeñas vías respiratorias (vías respiratorias que tiene un diámetro medio entre 300 y 899 m) en secciones de pulmón incluidos en parafina teñidas con tricrómico de Masson.
Protocol
Representative Results
Discussion
Most researcher use mice to model the main chronic lung pathologies and abnormal lung physiology in COPD (airspace enlargement, SAR, and increases in lung compliance) present in the human disease. A comprehensive approach to assess the effect of molecules of interest on both emphysema development and SAR is needed in mice in order to comprehensively assess the activities of molecules of interest in these chronic disease processes.
There are several critical steps in this protocol. First, dur…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos agradecer a Francesca Polverino MD, investigador en el Hospital Brigham y de la Mujer, por su contribución a este artículo, y también Mónica Yao, BS, y Kate Rydell, BS por su ayuda con la cría de murino y la exposición de los ratones al humo del cigarrillo.
Este trabajo fue apoyado por el Servicio Público de Salud, Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre Instituto Subvenciones HL111835, HL105339, HL114501, asistentes de vuelo Instituto de Investigación Médica Grant # CIA123046, el Brigham and Institute Hospital Lovelace respiratoria Consorcio de Investigación de la Mujer, y el Cambridge NIHR Biomédica Centro de Investigación.
Materials
| Whole-body smoke exposure device | Teague Enterprise | TE-10z | Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice |
| Research Cigarette | University of Kentucky | 3R4F reference cigarettes | |
| Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm | Pall Corporation | 7219 | For measurement of TPMs |
| 25 mm filter holder | Pall Corporation | ||
| Filter sampler | Intermatic | Metal T100 | |
| Gas meter | AEM | Gas meters G1.6; G2.5; G4 | |
| Tracheal Cannula for mouse 18 gauge | Labinvention | Analysis of pulmonary function | |
| Mechanical ventilator | Scireq | FlexiVent | |
| Gill's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | GSH316 | For Gill staining, work under a fume hood |
| Hematoxylin solution, Harris modified | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Cytoseal-60 | Thermo Scientific | 8310-16 | |
| Micro-Slide-Field-Finder | Andwin Scientific INC | 50-949-582 | For analysis of emphysema |
| Scion Image Program | Scion Corporation | ||
| Mason's trichrome stain | Sigma-Aldrich | HT15 | For analysis of small airway fibrosis |
| MetaMorp Offline version 7.0 | Molecullar Devices LLC | 31032 |
Referências
- Murray, C. J., Lopez, A. D. Measuring the global burden of disease. N. Engl. J Med. 369, 448-457 (2013).
- Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Am. J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 295, 1-15 (2008).
- Hautamaki, R. D., Kobayashi, D. K., Senior, R. M., Shapiro, S. D. Requirement for macrophage elastase for cigarette smoke-induced emphysema in mice. Science. 277, 2002-2004 (1997).
- Churg, A., et al. Late intervention with a myeloperoxidase inhibitor stops progression of experimental chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit Care Med. 185, 34-43 (2012).
- Churg, A., Zhou, S., Wang, X., Wang, R., Wright, J. L. The role of interleukin-1beta in murine cigarette smoke-induced emphysema and small airway remodeling. Am J Respir. Cell Mol. Biol. 40, 482-490 (2009).
- Hogg, J. C., et al. The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. N. Engl. J. Med. 350, 2645-2653 (2004).
- Paigen, K. A miracle enough: the power of mice. Nat. Med. 1, 215-220 (1995).
- Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clin. Sci. (Lond). 126, 253-265 (2014).
- Churg, A., Tai, H., Coulthard, T., Wang, R., Wright, J. L. Cigarette smoke drives small airway remodeling by induction of growth factors in the airway wall). Am. J. Respir. Crit Care Med. 174, 1327-1334 (2006).
- Guerassimov, A., et al. The development of emphysema in cigarette smoke-exposed mice is strain dependent. Am. J. Respir. Crit Care Med. 170, 974-980 (2004).
- van Eijl, S., van Oorschot, R., Olivier, B., Nijkamp , F. P., Bloksma, N. Stress and hypothermia in mice in a nose-only cigarette smoke exposure system. Inhal. Toxicol. 18, 911-918 (2006).
- Mauderly, J. L., et al. Comparison of 3 methods of exposing rats to cigarette smoke. Exp. Pathol. 37, 194-197 (1989).
- Yao, H., et al. Extracellular superoxide dismutase protects against pulmonary emphysema by attenuating oxidative fragmentation of ECM. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 15571-15576 (2010).
- Crane-Godreau, M. A., et al. Modeling the influence of vitamin D deficiency on cigarette smoke-induced emphysema. Front Physiol. 4, 132 (2013).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. J Vis. Exp. , e50172 (2013).
- De Vleeschauwer, S. I., et al. Repeated invasive lung function measurements in intubated mice: an approach for longitudinal lung research. Lab Anim. 45, 81-89 (2011).
- Dunnill, M. S. Quantitative methods in the study of pulmonary pathology. Thorax. 17, 320-328 (1962).
- Saetta, M., et al. Destructive index: a measurement of lung parenchymal destruction in smokers. Am Rev. Respir. Dis. 131, 764-769 (1985).
- Saito, K., Cagle, P., Berend, N., Thurlbeck, W. M. The ‘destructive index’ in nonemphysematous and emphysematous lungs. Morphologic observations and correlation with function. Am Rev. Respir. Dis. 139, 308-312 (1989).
- Robbesom, A. A., et al. Morphological quantification of emphysema in small human lung specimens: comparison of methods and relation with clinical data. Mod. Pathol. 16, 1-7 (2003).
- Moghadaszadeh, B., et al. Selenoprotein N deficiency in mice is associated with abnormal lung development. FASEB J. 4, 1585-1599 (2013).
- Churg, A., Sin, D. D., Wright, J. L. Everything prevents emphysema: are animal models of cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease any use. Am J Respir. Cell Mol. Biol. 45, 1111-1115 (2011).
- McComb, J. G., et al. CX3CL1 up-regulation is associated with recruitment of CX3CR1+ mononuclear phagocytes and T lymphocytes in the lungs during cigarette smoke-induced emphysema. Am. J. Pathol. 173, 949-961 (2008).
- Mizumura, K., et al. Mitophagy-dependent necroptosis contributes to the pathogenesis of COPD. J. Clin. Invest. 124, 3987-4003 (2014).
