Geautomatiseerde Meting van longemfyseem en Kleine luchtweg remodeling in sigarettenrook blootgesteld Muizen
Summary
The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.
Abstract
COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill’s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson’s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.
Introduction
Het gebruik van diermodellen COPD studie is uitdaging omdat geen model perfect repliceren alle kenmerken van de menselijke ziekte (2). De meeste onderzoekers gebruiken muizen model COPD vanwege de overeenkomsten tussen muizen en mensen in de pulmonale fysiologie, pathologie, genetica en metabolieten. Ook muizen zijn relatief goedkoop om te studeren, en zowel longemfyseem en kleine luchtwegremodelling ontwikkelen binnen 6 maanden van CS blootstelling (5,7-9).
Sigarettenrook geïnduceerde COPD: Verschillende methoden kunnen COPD induceren in muizen. De meeste onderzoekers blootstellen muizen CS, die de voornaamste etiologische factor voor menselijke COPD. CS blootstelling gedurende 6 maanden leidt de ontwikkeling van emfyseem en kleine luchtwegremodellering (SAR) bij muizen, maar de ernst van de ziekte die wordt geïnduceerd afhankelijk van het muizen stam onderzocht. Bijvoorbeeld, NZWLacZ muizen zijn bestand tegen de ontwikkeling van CS-geïnduceerd emfyseem dat AKR / J muizen extremely gevoelige (10). De meeste onderzoekers bestuderen C57BL / 6 muizen muizen in de CS blootstellingsmodel zoveel van transgene muizen in deze stam. Na 6 maanden CS blootstelling, emfyseem en kleine luchtwegen fibrose ontwikkelen wildtype (WT) C57BL / 6 muizen, en beide laesies zijn relatief mild van aard (5,10). De onderzoekers maken gebruik van twee soorten CS blootstelling: neus-only en het hele lichaam blootstellingen. De belangrijkste nadelen van de neus alleen belichtingstechniek zijn dat: 1) het is een arbeidsintensieve methode; en 2) muizen worden tegengehouden in kleine cellen die een stressrespons en hyperthermie in de dieren (11) kan induceren. Het grote nadeel van blootstelling gehele lichaam (hierin beschreven) dat de dieren kunnen innemen (evenals inademen) nicotine en teer producten wanneer ze schoon hun vacht. Muizen blootgesteld aan lichaamstrillingen CS hebben een lager carboxyhemoglobine niveaus en een vermindering van verlies van lichaamsgewicht in vergelijking met dieren blootgesteld aan neus slechts CS (12).
<p class = "jove_content"> longfunctietest (PFT): Handelingen longflexibiliteit en elasticiteit zijn gewoonlijk soortgelijk in C57BL / 6 wild type (WT) muizen blootgesteld aan lucht of CS gedurende 6 maanden als gevolg van de relatief milde emfyseem dat wanneer deze zich ontwikkelt stam wordt blootgesteld aan CS (10). Echter, wanneer emfysemateus vernietiging ernstiger toename longflexibiliteit en links verschuivingen in de druk-volume (PV) stroom lussen worden gedetecteerd. De laatste kan worden waargenomen, bijvoorbeeld in muizenstammen die meer vatbaar voor de effecten van CS (10), CS-blootgestelde C57BL / 6 stam van transgene muizen die een meer ernstige vorm emfyseem dan C57BL / 6 muizen WT (13), of CS-blootgestelde muizen blootgesteld aan omgevingsveranderingen dat ze meer vatbaar voor de effecten van CS (14) maken. Dit protocol maakt gebruik van een klein dier ventilator tot een vermindering van de elastische terugslag van de long (verhogingen van de quasi-statische longcompliantie [Constante] en verminderingen in het weefsel te metenelastantie [H]), PV stroom loops, en veranderingen in de luchtwegen en weefsel weerstand in verdoofde muizen (15,16).Maatregelen van longemfyseem: Analyse van emfyseem ontwikkeling in CS-blootgestelde C56BL / 6 stam muizen is uitdagend omdat de distributie is ruimtelijk heterogeen. Verschillende methoden kwantificeren luchtruim uitbreiding in muizen. De eerste methode was de gemiddelde lineaire intercept (L m) (17). De L m methode is een langzaam, handmatig proces die de heterogeniteit van de ziekte (tenzij alle delen van de long willekeurig bemonsterd) en het gebruik ervan kan derhalve voor de waarnemer voorspanning in de analyse kan vangen. De destructieve index [DI, (18)] kwantificeert ook het luchtruim uitbreiding met behulp van een transparant vel met 50 gelijk verdeeld punten geplaatst over een gedrukte gedigitaliseerde beeld van een hematoxyline en eosine gekleurd long sectie. De PI-methode scoort het gebied rondom elk punt acgens de mate waarin de alveolaire leidingen en alveolaire wanden binnen dit gebied worden vernietigd. Het belangrijkste nadeel van de DI methode is dat het tijdrovend en niet nauwkeuriger dan andere methoden (19,20).
Dit protocol maatregelen betekenen alveolaire koordelengte en alveolaire gebied op paraffine ingebedde longcoupes gekleurd met Gill's vlek. Morfometrie software zet afbeeldingen longsecties voor binaire afbeeldingen (waarin weefsel wit en luchtruim zwart) en superponeert een uniform raster van horizontale en verticale lijnen (akkoorden) en de software kwantificeert dan de lengte van elk akkoord in gebieden die door software als het luchtruim. Met deze methode is het mogelijk om de grootte van de alveoli in alle delen van de long in een gestandaardiseerde en relatief geautomatiseerde wijze (21) te meten.
Kleine luchtwegremodelling (SAR): De toegenomen afzetting van ECM eiwitten (vooral interstitial collagenen) rond kleine luchtwegen optreedt in CS-blootgestelde dieren en draagt obstructie luchtstroom. Onderzoekers niet bestuderen SAR in diermodellen van COPD zo vaak als emfyseem ontwikkeling (22). Om SAR kwantificeren CS-blootgestelde muizen gebruikt dit protocol beeldanalyse software om de dikte van de laag van ECM eiwitten die wordt afgezet rond de kleine luchtwegen (luchtwegen met een gemiddelde diameter tussen 300 en 899 m) in paraffine ingebedde longsecties meten gekleurd met Masson trichroomkleuring vlek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Most researcher use mice to model the main chronic lung pathologies and abnormal lung physiology in COPD (airspace enlargement, SAR, and increases in lung compliance) present in the human disease. A comprehensive approach to assess the effect of molecules of interest on both emphysema development and SAR is needed in mice in order to comprehensively assess the activities of molecules of interest in these chronic disease processes.
There are several critical steps in this protocol. First, dur…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen Francesca Polverino MD, een Research Fellow aan de Brigham and Women's Hospital bedanken voor haar bijdrage aan dit artikel, en ook Monica Yao, BS, en Kate Rydell, BS voor hun hulp met muizen veeteelt en het blootstellen van de muizen aan sigarettenrook.
Dit werk werd ondersteund door de GGD, National Heart, Lung, and Blood Institute Subsidies HL111835, HL105339, HL114501, Stewarden Medical Research Institute Grant # CIA123046, het Brigham and Women's Hospital-Lovelace Respiratory Research Institute Consortium, en de Cambridge NIHR Biomedische Centrum voor Onderzoek.
Materials
| Whole-body smoke exposure device | Teague Enterprise | TE-10z | Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice |
| Research Cigarette | University of Kentucky | 3R4F reference cigarettes | |
| Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm | Pall Corporation | 7219 | For measurement of TPMs |
| 25 mm filter holder | Pall Corporation | ||
| Filter sampler | Intermatic | Metal T100 | |
| Gas meter | AEM | Gas meters G1.6; G2.5; G4 | |
| Tracheal Cannula for mouse 18 gauge | Labinvention | Analysis of pulmonary function | |
| Mechanical ventilator | Scireq | FlexiVent | |
| Gill's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | GSH316 | For Gill staining, work under a fume hood |
| Hematoxylin solution, Harris modified | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Cytoseal-60 | Thermo Scientific | 8310-16 | |
| Micro-Slide-Field-Finder | Andwin Scientific INC | 50-949-582 | For analysis of emphysema |
| Scion Image Program | Scion Corporation | ||
| Mason's trichrome stain | Sigma-Aldrich | HT15 | For analysis of small airway fibrosis |
| MetaMorp Offline version 7.0 | Molecullar Devices LLC | 31032 |
Referências
- Murray, C. J., Lopez, A. D. Measuring the global burden of disease. N. Engl. J Med. 369, 448-457 (2013).
- Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Am. J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 295, 1-15 (2008).
- Hautamaki, R. D., Kobayashi, D. K., Senior, R. M., Shapiro, S. D. Requirement for macrophage elastase for cigarette smoke-induced emphysema in mice. Science. 277, 2002-2004 (1997).
- Churg, A., et al. Late intervention with a myeloperoxidase inhibitor stops progression of experimental chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit Care Med. 185, 34-43 (2012).
- Churg, A., Zhou, S., Wang, X., Wang, R., Wright, J. L. The role of interleukin-1beta in murine cigarette smoke-induced emphysema and small airway remodeling. Am J Respir. Cell Mol. Biol. 40, 482-490 (2009).
- Hogg, J. C., et al. The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. N. Engl. J. Med. 350, 2645-2653 (2004).
- Paigen, K. A miracle enough: the power of mice. Nat. Med. 1, 215-220 (1995).
- Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clin. Sci. (Lond). 126, 253-265 (2014).
- Churg, A., Tai, H., Coulthard, T., Wang, R., Wright, J. L. Cigarette smoke drives small airway remodeling by induction of growth factors in the airway wall). Am. J. Respir. Crit Care Med. 174, 1327-1334 (2006).
- Guerassimov, A., et al. The development of emphysema in cigarette smoke-exposed mice is strain dependent. Am. J. Respir. Crit Care Med. 170, 974-980 (2004).
- van Eijl, S., van Oorschot, R., Olivier, B., Nijkamp , F. P., Bloksma, N. Stress and hypothermia in mice in a nose-only cigarette smoke exposure system. Inhal. Toxicol. 18, 911-918 (2006).
- Mauderly, J. L., et al. Comparison of 3 methods of exposing rats to cigarette smoke. Exp. Pathol. 37, 194-197 (1989).
- Yao, H., et al. Extracellular superoxide dismutase protects against pulmonary emphysema by attenuating oxidative fragmentation of ECM. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 15571-15576 (2010).
- Crane-Godreau, M. A., et al. Modeling the influence of vitamin D deficiency on cigarette smoke-induced emphysema. Front Physiol. 4, 132 (2013).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. J Vis. Exp. , e50172 (2013).
- De Vleeschauwer, S. I., et al. Repeated invasive lung function measurements in intubated mice: an approach for longitudinal lung research. Lab Anim. 45, 81-89 (2011).
- Dunnill, M. S. Quantitative methods in the study of pulmonary pathology. Thorax. 17, 320-328 (1962).
- Saetta, M., et al. Destructive index: a measurement of lung parenchymal destruction in smokers. Am Rev. Respir. Dis. 131, 764-769 (1985).
- Saito, K., Cagle, P., Berend, N., Thurlbeck, W. M. The ‘destructive index’ in nonemphysematous and emphysematous lungs. Morphologic observations and correlation with function. Am Rev. Respir. Dis. 139, 308-312 (1989).
- Robbesom, A. A., et al. Morphological quantification of emphysema in small human lung specimens: comparison of methods and relation with clinical data. Mod. Pathol. 16, 1-7 (2003).
- Moghadaszadeh, B., et al. Selenoprotein N deficiency in mice is associated with abnormal lung development. FASEB J. 4, 1585-1599 (2013).
- Churg, A., Sin, D. D., Wright, J. L. Everything prevents emphysema: are animal models of cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease any use. Am J Respir. Cell Mol. Biol. 45, 1111-1115 (2011).
- McComb, J. G., et al. CX3CL1 up-regulation is associated with recruitment of CX3CR1+ mononuclear phagocytes and T lymphocytes in the lungs during cigarette smoke-induced emphysema. Am. J. Pathol. 173, 949-961 (2008).
- Mizumura, K., et al. Mitophagy-dependent necroptosis contributes to the pathogenesis of COPD. J. Clin. Invest. 124, 3987-4003 (2014).
