미세 아교 세포와 신경 세포에 대한 예 염색 : 저온 절단 된 쥐의 뇌 조직에서 면역 조직 화학에 대한 입문서
Summary
This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.
Abstract
면역 조직 화학은 동일계에서 항원의 존재, 위치 및 상대적인 풍부함을 검출하기위한 널리 이용되는 기술이다. 이 초급 프로토콜 및 미세 아교 예로서 신경 요소의 마커를 사용하여, 시약, 장비 및 설치류 뇌 조직의 면역 조직 화학 염색을 완료하기 위해 필요한 기술들을 설명한다. 특히,이 논문은 각각 Iba1과 팬의 연결에 대한 면역 조직 화학 염색을 통해 미세 아교 세포와 신경 세포의 형광 시각화를위한 단계별 프로토콜입니다. 형광 이중 라벨링 정확하게 세포 유형, 수용체, 리간드 사이의 상호 작용을 관찰 할 수있는 기회를 제공하고, 동일한 샘플 내의 다중 단백질의 위치 파악에 특히 유용하며, 및 / 또는 서로뿐만 아니라 단백질 공동과 관련된 세포 외 기질 하나의 셀 내에서 지역화. 다른 시각화 기술과는 달리, 형광 면역 조직 화학 염색의 강도가 감소 할 수있다적절한 예방 조치가되지 않는 한, 염색 다음 달에 주. 형광은 더 효율적이고, 두 개 이상의 사이보다 정확한 분화 가능으로 이러한 제한에도 불구하고, 많은 어플리케이션에서 형광 이중 표지, 예컨대 3,3'- 디아 미노 벤지딘의 tetrahydrochloride (DAB) 또는 알칼리성 포스파타제 (AP)와 같은 대안보다 선호 마커. 토론은 문제 해결 팁과 성공을 촉진하기 위해 조언을 포함한다.
Introduction
면역 관심 항원에 특이 적으로 결합하는 일차 항체를 사용하여 조직 절편에서 항원 (예 : 단백질)를 검출하기위한 공정이다. 그는 항체가 큰 특이성 1 항원을 지역화 할 수 있다고 판단 할 때 면역은 1934 년 JR Marrack에 의해 개척되었다. 1942 년부터, 면역 조직 화학 염색을 시각화하기 위해 형광 항체를 사용하여 연구를 체외에서 첫 번째의 일부는 생체 조직 화학적 연구에서 처음으로 4 발표 된 후 2,3, 출판되었다. 1960 년대, 삼십년 면역 조직 화학 방법의 개시 후, 효소 결합 된 항체는 보조 시약으로 사용되기 시작했다. 이 방법은 동시에 독립적으로 프랑스와 미국 5,6에서 개발되었다. 오늘, 항체의 다양한는 면역 조직 화학 연구 (7)에 대한 무한한 가능성을 제공합니다.
">이 대응의 전반적인 목표는 면역 조직 화학 염색에 대한 간략한 소개를 제공하는 것입니다, 그것은이 기술의 포괄적이고 철저한 검토하기위한 것이 아닙니다 설명 된 방법에있어서,이 항원에 대한 면역 조직 화학 기술은 미세 아교 세포에 대한 (마커를 제공하고 있습니다. 관류 파라 포름 알데히드의 염색 뉴런), 자당 cryoprotected, 저온 절단 된 쥐의 뇌. 면역 조직 화학 염색을 배경 염색을 줄이기 위해 결합 특이 항원을 차단 시작한다. 다음으로, 일차 항체와 배양이 조직의 특정 항원에 결합이 가능합니다. 차 항체에 따라, 다른 항체를 이차 항체로 명명 공액 시각화 신호 8 차 항체를 링크에 적용된다. 이차 항체 차 항체가 발생시킨 종에 특이적인 면역 글로불린 G (IgG의) 도메인을 대상. 이차 항체는 신호를 증폭 차 항체의 T의 팹 지역부터차 항체의 IgG의 도메인에 여러 사이트에 그가 차 항체 바인드. 어느 차 항체의 F C 영역에 결합 효소 또는 형광 분자 시각화를 가능하게한다. 예를 들어, 토끼 항 Iba1 일차 항체에 특이 Iba1 토끼의 IgG 분자이다. 당나귀 항 – 토끼 IgG를 이차 항체가로인가 될 때, 인식하고 토끼 항 Iba1의 IgG의 복수의 영역 (도 1 참조)에 결합된다. 당나귀 항체는 다양한 방법에 의해 시각화 될 수있다. 이 통신은 형광 현미경으로 시각화를위한, 차 항체를 인식하는 이차 항체에 결합 형광 검출에 초점을 맞추고있다. 형광 면역 조직 화학에서, 이러한 훽스트 또는 DAPI와 같은 핵 염색은 모든 핵을 시각화 할 수있다.
그림 1 :의 SCH직접 대 간접 항체 라벨링 기술 ematic 표현. 항체는 관심있는 항원에 결합하여 일차 항체 종에 대해 발생하는 이차 항체에 의해 증폭 될 수있다. 이 기술은 시각화 (A)에 대한 증폭 및 DAB 용 아비딘 – 바이오틴 복합체 (ABC)를 사용하여 수행 할 수있다 또는 형광 직접 접합 된 이차 항체 (B). 또한, 일차 항체가 직접 비오틴 또는 형광 (C) 등 다양한 태그와 결합 될 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
(DAB;도 1 및도 2 참조) 면역 조직 화학 염색의 시각화를위한 다른 방법은 3,3'- 디아 미노 벤지딘의 tetrahydrochloride를 이용한다. 이 비오틴 화를 사용하여 형광 또는 상이밝은 필드 현미경 아래에서 볼 수있는 침전물에 DAB를 변환하는 효소를 제공 말 무 퍼 옥시 다제 (HRP) 복합 이차 항체,. 단일 항원 관심 또는 염색이 오래 지속되는 것이 요구되는 경우에, DAB 형광 염색보다 더 적합 할 수있다. 그러나, DAB 염색은 두 개의 핵 항원이 관심있는 특히, 여러 마커 사이의 차별화에 적합하지 않습니다. DAB 재료 및 프로토콜 변경에 대한 자세한 내용은 표 1를 참조. 대안으로는, 니트로 블루 테트라 졸륨 클로라이드 / 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 릴 포스페이트 (NBT / BCIP)는 이차 공액 알칼리성 포스파타제 (AP)를 시각화하기 위해 사용될 수있다 항체.
그림 2 :. 니켈 강화 DAB 하나의 표지 쥐의 뇌 조직 섹션의 대표 이미지 쥐의 뇌는 SE는혼자 미세 아교 세포 또는 뉴런의 오래 지속되는 분석을 허용 Iba1 (A)와 팬의 연결 (B)을 위해 니켈이 강화 된 DAB로 표시되어 있습니다 ctions. 스케일 바 20 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
하나는 조직 내에서 관심있는 항원의 존재 량 추정 분석되는 것을 고려한다. 간접 방법은 위에서 설명한대로 낮은 풍부한 목표에 유용하다. 관심 항원 높은 풍부하게되면 직접 방법이 적용될 수있다. 직접 방법은 직접 시각화 신호에 결합되는 일차 항체를 포함하고, 따라서 어떤 차 항체가 필요하지 않습니다. 이 방법은 염색 공정을 단순화하지만, 간접적 인 방법에 의해 달성 증폭을 제거한다. 직접 복합 일차 항체를 사용하여 이차 항체의 교차 반응을 제거때 두 번 라벨.
이 통신은 Iba1과 팬의 연결 (표 1의 세부 사항)와 이중 라벨에 대한 프로토콜을 자세히 설명합니다. Iba1는 분지, 하이퍼 분지의 활성화, 아메바, 및로드 등 많은 활성화 상태에서 미세 아교 세포를 얼룩. 팬 신경 얼룩 신경 축삭 돌기, 그리고 소마. Iba1 대부분의 미세 아교 세포와 팬의 연결 대상에게 신경을 얼룩 때문에, 얼룩의 조합은 미세 아교 세포 – 신경 세포 상호 작용의 폭 넓은 이해를 얻는 데 유용합니다.
결론적으로, 면역 조직 화학 염색은 항체의 신중한 선택에 의존한다. 연구 문제는보다 구체적인 해짐에 따라, 다른 항원에 제기 항체는 바람직 할 수있다. 특정 소교 활성화 상태를 대상으로, 하나는 오히려 Iba1보다, CD45 또는 CD68 항체를 사용하도록 선택할 수 있습니다. 또한, 마우스를 작동에서 F4 / 80은 필요한 결과를 제공 할 수있다. 마찬가지로, 신경 요소는 특히 항체 류마티스 관절염의 대상이 될 수 있습니다핵에 대한에 다루지, 시냅스 (사전 또는 사후), 축삭, 성장 콘. 또한, 신경 세포 (더블 cortin, NeuN)의 나이를 구별 다른 마커 및 신경 재생 (GAP-43)이있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 통신의 전반적인 목표는 독자에게 면역 조직 화학 절차를 소개했다. 이를 위해, Iba1 및 팬 신경 항원에 두 번 라벨의 예는 미세 아교 세포 및 관류 파라 포름 알데히드의 신경 세포를 관찰하기 위해, 자당 cryoprotected, 저온 절단 된 쥐의 뇌를 사용 하였다.
이 기술은 무단 목적을 제공하도록 구성 될 수있다. 뇌, 폐, 간, 신장, 소장에 제한 등 아니라 조직 유형의 다양한 상이한…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Mr. Ryan Hart and Mr. Arriz Lucas for their invaluable feedback on this communication. This work was supported by NIH NINDS R01 NS065052 and Phoenix Children’s Hospital Mission Support Funds.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides | Fisher Scientific | 22-034-979 | Used for tissue mounting (1.2.2) |
| Oven | Thermo Scientific | 51028112 | Used for tissue drying (2.1.1) |
| Mini Pap pen | Life Technologies | 00-8877 | Used in step 2.2.2 |
| Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish | Fisher Scientific | 22-149-429 | Used for all washes during staining (2.2), as well as the Hoechst step (2.2.8) |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Used for drying slides (2.2) |
| Black Staining Box | Ted Pella | 21050 | Used for blocking and staining steps (2.2) |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | 50-413-253 | Used for block and antibody incubation (2.2) |
| Mouse α-Pan-neuronal | Millipore | MAB2300 | Used for primary antibody (2.2.4) |
| Rabbit α-Iba1 | Wako Chemical | 019-19741 | Used for primary antibody (2.2.4) |
| Donkey α-Rabbit 594 | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | Used for secondary antibody (2.2.6) |
| Donkey α-mouse 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Used for secondary antibody (2.2.6) |
| Caterer's foil | Any | N/A | Used in steps 1.2.2 and 2.3.2 |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Clear Nail Polish | Any | N/A | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal) | Carl Zeiss | N/A | Used for imaging (3) |
| Axioskop A2 | Carl Zeiss | N/A | Used for imaging (3) |
| CitriSolv | FisherScientific | For DAB protocol | |
| ABC | Vector Laboratories | PK-6100 | For DAB protocol |
| DAB Peroxidase kit | Vector Laboratories | SK-4100 | For DAB protocol |
| Biotinylated horse α-rabbit IgG | Vector Laboratories | BA-1100 | For DAB protocol |
| Biotinylated horse α-mouse IgG | Vector Laboratories | BA-2001 | For DAB protocol |
| 30% Hydrogen Peroxide | FisherScientific | H325-500 | For DAB protocol |
| Wheaton slide racks and staining dishes | TedPella | 21043 | For DAB protocol |
| Masterflex perfusion pump and tubing | Cole-Parmer | Used for perfusion (1.1.1 and 1.1.2) | |
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used for tissue freezing (1.2.1) |
| Thermometer (-50 to 50 C) | Fisher Scientific | 15-059-228 | Used for tissue freezing (1.2.1) |
| Cryostat | Leica | CM3500S | Used for tissue sectioning (1.2.2) |
| Staining Dish, Plastic with 2 Lids | Grale Scientific | 353 | For antigen retrival |
| 20 Place Staining Rack, Slides Horizontal | Grale Scientific | 354 | For antigen retrival |
| Microwave | Any | N/A | For antigen retrival |
Referências
- Marrack, J. R. Chemistry of antigens and antibodies. Nature. 134, 468-469 (1934).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. J Immunol. 45, 159-170 (1942).
- Marshall, J. M. Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods. The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).
- Mellors, R. C. Histochemical demonstration of the in vivo localization of antibodies: antigenic components of the kidney and the pathogenesis of glomerulonephritis. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 3, 284-289 (1955).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
- Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. Comptes rendus hebdomadaires des seances de l’Academie des sciences. Serie D: Sciences naturelles. 262, 2543-2545 (1966).
- Cuello, A. C. . Immunohistochemistry. , (1983).
- Junqueira, L. C. U., Mescher, A. L. . Junqueira’s basic histology : text and atlas. , (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Christensen, N. K., Winther, L., Kumar, G. L., Rudbeck, L. . Education Guide: Immunohistochemical (IHC) staining methods. , 103-108 (2009).
- Wang, G., Achim, C. L., Hamilton, R. L., Wiley, C. A., Soontornniyomkij, V. Tyramide signal amplification method in multiple-label immunofluorescence confocal microscopy). Methods. 18, 459-464 (1999).
- Feldengut, S., Del Tredici, K., Braak, H. Paraffin sections of 70-100 mum: a novel technique and its benefits for studying the nervous system. Journal of neuroscience methods. 215, 241-244 (2013).
