केल्विन जांच बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग बैक्टीरिया की सतह संभावित मापन

Summary

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Abstract

सतह संभावित सतहों सब्सट्रेट करने के लिए सूक्ष्मजीवों के आसंजन में एक प्रमुख भूमिका निभाता है कि एक सामान्य अनदेखी की शारीरिक विशेषता है। केल्विन जांच बल माइक्रोस्कोपी (KPFM) नैनो पैमाने पर सतहों के बीच संपर्क संभावित अंतर उपाय है कि परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) के एक मॉड्यूल है। AFM के साथ KPFM के संयोजन सतह संभावित और इस तरह के बैक्टीरियल कोशिकाओं के रूप में जैविक नमूने का स्थलाकृतिक नक्शे के एक साथ पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। यहाँ, हम इस तरह के स्टेनलेस स्टील और सोने के रूप में चिकित्सकीय प्रासंगिक सतहों के लिए माइक्रोबियल आसंजन पर सतह क्षमता के प्रभाव की जांच करने के लिए KPFM रोजगार। सतह संभावित नक्शे अलग सामग्री substrates पर माइक्रोबियल झिल्ली के लिए सतह क्षमता में मतभेद का पता चला। एक कदम ऊंचाई ग्राफ सब्सट्रेट सतह और सूक्ष्मजीवों के बीच एक सीमा क्षेत्र में सतह क्षमता में अंतर दिखाने के लिए तैयार की गई थी। सेलुलर झिल्ली सतह क्षमता में परिवर्तन परिवर्तन के साथ जोड़ दिया गया हैसेलुलर चयापचय और गतिशीलता में एस। इसलिए, KPFM विभिन्न सब्सट्रेट सतहों आसंजन पर माइक्रोबियल झिल्ली सतह क्षमता के परिवर्तन की जांच करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है। इस अध्ययन में, हम KPFM का उपयोग कर स्टेनलेस स्टील और सोने पर व्यक्तिगत मेथिसिलिन प्रतिरोधी Staphylococcus aureus USA100 कोशिकाओं की सतह संभावित चिह्नित करने के लिए प्रक्रिया प्रदर्शित करता है।

Introduction

Biofilms हटाने के लिए अड़ियल होते हैं और रोग पारेषण और रोगाणुरोधी प्रतिरोध की वृद्धि दर के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के रूप में उपकरण सतहों पर और त्वचीय घाव में उत्पादित biofilms चिकित्सा उद्योग के लिए एक समस्या प्रस्तुत करते हैं। अनुलग्नक biofilm गठन में पहला कदम है और इसके उलटने ^1-3 की वजह से सबसे महत्वपूर्ण कदम है। सब्सट्रेट सतह विशेषताओं माइक्रोबियल लगाव पर एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। ऐसी सतह कठोरता, सरंध्रता, खुरदरापन, और hydrophobicity कारक के रूप में माइक्रोबियल लगाव असर दिखाया गया है; हालांकि, माइक्रोबियल आसंजन पर सब्सट्रेट सतह संभावित (सपा) की भूमिका की जांच के छोटे से अनुसंधान ^4,5 किया गया है। नकारात्मक आरोप लगाया सतहों अभ्रक, सिलिकॉन, और सोने ^{से 6} बेसिलस thuringiensis बीजाणुओं का लगाव को रोकने के। सेलुलर झिल्ली क्षमता में परिवर्तन सेलुलर लगाव और गतिशीलता ^5,7 में परिवर्तन के संकेत हैं। यह विद्युत hom देखा गया है किogeneous सतहों और अधिक आसानी से माइक्रोबियल आसंजन ⁵ बढ़ावा देने के। Nanoscale पर बैक्टीरिया की सतह संभावित निस्र्पक विरोधी जैव अवरोध रणनीतियों के विकास में सहायता कर सकते हैं, जिससे विभिन्न सतहों के लिए बैक्टीरिया के आसंजन कैनेटीक्स को समझने के लिए एक उपन्यास तरीका प्रदान करते हैं, और कर सकते हैं। ऐसे electrophoretic प्रकाश बिखरने, जीटा संभावित है, और समविद्युतविभव बिंदु दृढ़ संकल्प के रूप में बैक्टीरिया की विद्युत कैनेटीक्स निस्र्पक के लिए इस्तेमाल अन्य विधियों के विपरीत, केल्विन जांच बल माइक्रोस्कोपी (KPFM) व्यक्ति की कोशिकाओं के बजाय पूरे संस्कृतियों ^8-11 की परीक्षा के लिए अनुमति देता है। सेल सेल तुलना या उच्च सटीकता और परिशुद्धता के साथ विद्युत विशेषताओं biofilm करने के लिए इच्छुक है, जब यह फायदेमंद है।

KPFM परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) के एक मॉड्यूल है। AFM के स्कैनिंग टनलिंग माइक्रोस्कोप (एसटीएम) ¹² का एक सीधा परिणाम के रूप में विकसित किया गया था। एसटीएम का उपयोग कर पहली बार प्रकाशित छवियों 1982 ¹² में गर्ड बिन्निग और हेनरिक Rorhrer द्वारा किया गया </suपी>। अपने आविष्कार के हवा में एक प्रवाहकीय सतह पर एक तेज प्रवाहकीय टिप स्कैनिंग रेखापुंज द्वारा परमाणु संरचना को हल करने में सक्षम था। जल्दी छवि सूखे डीएनए, प्रोटीन के नमूने, और वायरस ^{से 12} एसटीएम का उपयोग करने का प्रयास किया है जो जीव उत्साहित उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने के निहितार्थ। एसटीएम भी विशेष जांच सुझावों ¹³ का उपयोग कर तरल पदार्थ में किया जा सकता है। इस लिंडसे एट अल।, सोने इलेक्ट्रोड पर ^13, 10 मिमी HClO ₄ में और पानी में छवि डीएनए अणु के लिए एसटीएम और AFM का इस्तेमाल किया है जो द्वारा दिखाया गया था। KPFM ligands के ²⁶ के साथ डीएनए और प्रोटीन विश्लेषण ²⁵ और biomolecules बातचीत के भूतल क्षमता का निर्धारण करने में प्रदर्शन किया गया है।

KPFM एक AFM प्रवाहकीय ब्रैकट टिप और एक आदर्श प्रवाहकीय नमूना के बीच संपर्क संभावित अंतर (सीपीडी) को मापने के द्वारा ^14,15 (, मैं चित्रा 1) चल रही है। नमूने जरूरी प्रवाहकीय (यानी, जैविक sampl होने की जरूरत नहीं हैते)। इमेजिंग अभ्रक, कांच, और जब तक गैर प्रवाहकीय सतह पतली है और एक अंतर्निहित प्रवाहकीय सामग्री ^6,7 के रूप में वहाँ सिलिकॉन सतहों (गैर प्रवाहकीय) पर बाहर किया जा सकता है। सीपीडी सतह संभावित वोल्टेज के बराबर है और नकारात्मक इलेक्ट्रॉन प्रभारी द्वारा विभाजित टिप (φ _टिप) और नमूना (φ _{नमूना)} के बीच काम कार्यों में अंतर है, के रूप में वर्णित किया जा सकता है (- ई)। एक प्रवाहकीय AFM टिप एक नमूना की सतह के करीब लाया जाता है जब कारण फर्मी ऊर्जा में अंतर (चित्रा 1, द्वितीय, एक) ¹⁵ के लिए एक विद्युत बल (एफ _ते) उत्पन्न होता है, (दूरी डी से विभाजित)। इस बिंदु पर, टिप और नमूना (ई _वी) के निर्वात ऊर्जा संतुलन और गठबंधन में हैं। करीब नमूना की सतह के लिए टिप लाने पर, टिप और नमूना की सतह समानांतर थाली capacitors के (चित्रा 1, द्वितीय, ख के रूप में बिजली के संपर्क और हरकत में आ गए </stronजी>) ^14,15। बिंदु पर, टिप और नमूना की सतह के फर्मी ऊर्जा एक स्थिर राज्य संतुलन तक पहुँचने गठबंधन हो गया (चित्रा 1, द्वितीय, ख)। टिप और नमूना की सतह के कारण ई _वी के और काम के कार्यों में एक फर्क करने के लिए शुल्क लिया जाएगा और एक वी _{सीपीडी} बनेगी। कारण का गठन वी _{सीपीडी} करने के लिए बिजली के संपर्क क्षेत्र पर एक एफ _तों कार्य करता है। इस बल बाद में (चित्रा 1, द्वितीय, सी) का गठन वी _{सीपीडी} के रूप में उसी परिमाण है कि टिप करने के लिए एक बाहरी वी _डीसी के आवेदन के माध्यम से निरस्त माना जाता है। इस डीसी वोल्टेज बिजली के संपर्क के क्षेत्र में सतह प्रभारी समाप्त आवेदन किया है, और वी _{सीपीडी} की एफ _तों को खत्म करने के लिए आवश्यक वी _डीसी की राशि एसए के बीच काम कार्यों में अंतर के बराबर हैmple सतह और टिप ^15। यह टिप का काम समारोह में जाना जाता है और यह निर्माताओं द्वारा प्रदान की जाती है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। सभी KPFM तरीकों में, एक एसी वोल्टेज (वी _एसी, लगभग 100-500 एम वी) भी टिप और नमूना ¹⁴ के बीच दोलन बिजली बलों को उत्पन्न करने के क्रम में टिप करने के लिए लागू किया जाता है। वी _{सीपीडी} और / या एफ _तों में परिवर्तन को मापने जब ​​यह बेहतर समाधान प्रदान करता है। इस संबंध में, आवृत्ति या बिजली दोलन के आयाम में परिवर्तन वी _डीसी द्वारा सही, और संभावित नक्शे उत्पन्न किया जा सकता सतह जा सकता है। इन मानचित्रों के विशिष्ट क्षेत्रों से डाटा आगे विशिष्ट स्थलाकृतिक सुविधाओं के बारे में बिजली की जानकारी प्रदान करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है।

(1) लिफ्ट मोड, (2) आयाम मॉड्यूलन (एएम) मोड, और (3) आवृत्ति मॉडुलन (एफएम) मोड ^14,16: KPFM तीन मोड में संचालित किया जा सकता है। लिफ्ट मोड प्रारंभिक इंक थाKPFM की arnation। लिफ्ट मोड एक डोलती टिप एक स्थलाकृतिक छवि प्राप्त करने के लिए सतह भर में घसीटा है, जिसमें एक दो-पास पद्धति पर निर्भर करता है। दूसरा पास के लिए टिप नमूना के ऊपर एक पूर्व निर्धारित दूरी उठाया है (10 – 100 एनएम) और वापस उसी क्षेत्र भर में स्कैन कर है। कारण AM- और एफएम-KPFM की तुलना में इस दो-पास विधि, लिफ्ट मोड, करने के लिए, छवि अधिग्रहण के लिए सबसे लंबे समय लेता है। सतह से दूर टिप बढ़ाने से ही लंबी दूरी की एफ _तों मापा जाता है कि यह सुनिश्चित करता है। इसके अलावा, स्थलाकृति और सतह संभावित माप के बीच पार बात की वृद्धि हुई पार्श्व संकल्प और संवेदनशीलता की कीमत पर decoupled है।

पूर्वाह्न-KPFM एक साथ नमूना स्थलाकृति और सतह क्षमता (एक-पास स्कैन) ¹⁴ को मापने के लिए दोहरे आवृत्तियों का उपयोग करके पार्श्व संकल्प और संवेदनशीलता को बेहतर बनाता है। पूर्वाह्न मोड में, ब्रैकट यंत्रवत् आम तौर पर 5% अपनी पहली गुंजयमान आवृत्ति नीचे, डोलती है (एफ _0), और विद्युत डोलती (Tअपनी दूसरी गुंजयमान आवृत्ति (एफ ₁₎ पर एक वी _एसी) hrough। कारण एफ _तों और वी _{सीपीडी} में परिवर्तन करने के लिए एफ ₁ के आयाम में परिवर्तन, सतह संभावित माप डेटा दे, जबकि स्थलाकृतिक डेटा की पीढ़ी के लिए एफ ₀ की बढ़त के आयाम में परिवर्तन,। एफ ₀ और ब्रैकट के एफ ₁ पार बात ¹⁴ कम से कम है का संकेत है कि महत्वपूर्ण आवृत्तियों और ऊर्जा से अलग हो रहे हैं। AFM की सिर इलेक्ट्रॉनिक्स बॉक्स (एचईबी) दोनों स्थलाकृतिक देने के लिए और एक स्कैन में एक साथ संभावित डेटा सतह के लिए दो संकेतों बाहर अलग करती है। एफएम-KPFM जैविक सतहों पर ¹⁴ संकल्प भी आगे से पूर्वाह्न-KPFM में सुधार। एफएम-KPFM यह विद्युत बल ढ़ाल के बजाय विद्युत बल (एफ _तों) ¹⁵ में परिवर्तन है कि उपायों में पूर्वाह्न-KPFM तुलना में अलग तरह से काम करता है। पूर्वाह्न मोड की तरह, एफएम मोड दोहरे आवृत्तियों और एक singl का इस्तेमालई-पास स्कैनिंग तंत्र स्थलाकृतिक प्राप्त करने और एक साथ ¹⁴ संभावित डेटा सतह के लिए। एफएम मोड में, ब्रैकट यंत्रवत् एफ ₀ में डोलती है और विद्युत एक कम संशोधित आवृत्ति पर डोलती _{(आधुनिक} एफ, आम तौर पर 1-5 किलोहर्ट्ज़)। Electrostatic बातचीत करने पर, ₀ और च _{आधुनिक विपणन} मिश्रण एफ ₀ ± च _{आधुनिक विपणन} च पक्ष बैंड का उत्पादन करने के लिए। ये sidebands विद्युत बल में परिवर्तन करने के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं, और AFM के एचईबी के माध्यम से एफ ₀ से अलग किया जा सकता है। एफएम-KPFM विद्युत बल ढ़ाल में परिवर्तन के उपायों के बाद से, सुझावों सुप्रीम आकार और उसके रखरखाव / अखंडता। समग्र सतह संभावित संकल्प ^{14, 15} में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं पूर्वाह्न उपयोग करते हुए संभावित संकल्प सतह और एफएम मोड पार्श्व 1 एनएम की रेंज में ¹⁴ हैं ^-16। यह KPFM इमेजिंग में (गैर-ध्रुवीय तरल पदार्थ में किया जा सकता है, और हाल ही में, कम-आयनिक (<10 मिमी) ध्रुवीय तरल पदार्थ में किया जाना दिखाया गया है कि ध्यान दिया जाना चाहिएऐसे MilliQ पानी के रूप में एक डीसी पूर्वाग्रह के आवेदन obviating, एक पूर्वाग्रह आपके सुझाव की आवश्यकता नहीं है, जो खुले पाश KPFM मोड); हालांकि, KPFM इमेजिंग अभी तक ध्रुवीय समाधान ^17-20 में जीवित कोशिकाओं पर किया जाना गया है। तरल में सपा इमेजिंग के साथ जुड़े अतिरिक्त चुनौतियों के समाधान आमतौर पर बनाए रखने की कोशिकाओं के लिए प्रयोग किया जाता है (यानी, फॉस्फेट बफर खारा) Faradaic प्रतिक्रियाओं, पूर्वाग्रह से प्रेरित आरोप गतिशीलता, और आयन प्रसार / पुनर्वितरण ²⁰ के लिए नेतृत्व करेंगे जो मोबाइल आयनों के उच्च सांद्रता है। इस प्रकार, इस प्रयोग के लिए, माप परिवेश की स्थिति के तहत पाली एल Lysine Functionalized स्टेनलेस स्टील और सोना सतहों पर सूखे और मृत मरसा कोशिकाओं से ले जाया गया। इमेजिंग पहले से सूखे या सतहों ²⁰ पर स्थिर कर दिया गया है कि जैविक नमूने पर हवा या वैक्यूम की स्थिति में बाहर किया जा सकता है। आर्द्र परिस्थितियों में भी सतहों ⁶ की KPFM इमेजिंग प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है।

इस अध्ययन में, हम एफएम-KPFM कार्यरतऔर AFM पाली एल Lysine Functionalized स्टेनलेस स्टील और सोना सतहों मेथिसिलिन प्रतिरोधी Staphylococcus aureus USA100 (मरसा) की कुर्की पर सपा की भूमिका की जांच करने के लिए। मरसा हाल ही में होने के कारण कई β-लेक्टम एंटीबायोटिक दवाओं और सेफैलोस्पोरिन ²¹ करने के लिए अपने स्वाभाविक रूप से चयनित प्रतिरोध करने के लिए एक बहु दवा प्रतिरोधी (एमडीआर) "superbug" के रूप में स्थिति हुई हैं। MRSA संक्रमण ऐसी vancomycin या लंबी अवधि के उपचार ^{में 22} के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता इसलिए मनुष्यों में उच्च विषाक्तता के स्तर है, और जो oxazolidinones के रूप में कठोर antimicrobials का उपयोग करने के लिए अग्रणी, अब इलाज के लिए अधिक चुनौतीपूर्ण मुश्किल है, और मजबूत हैं। स्टेनलेस स्टील अपनी चिकित्सा प्रासंगिकता और गोल्ड एक तुलनात्मक धातु के रूप में इस्तेमाल किया गया था आदि चमड़े के नीचे सुई, और bedpans, दरवाज़े के हैंडल, सिंक, में एक सामग्री के रूप में आम प्रयोग की वजह से चुना गया था। एफएम-KPFM माइक्रोबियल झिल्ली सपा substrates के लिए लगाव पर बदलता है अगर जांच करने के लिए उपयोग किया गया था।

Protocol

कांच के बने पदार्थ और संस्कृतियों के 1. तैयारी इस प्रयोग के साथ आगे बढ़ने से पहले, 5% भेड़ रक्त अगर (एसबीए) मरसा उगाने के लिए प्लेटें तैयार करते हैं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए एसबीए प्लेटें सेते …

Representative Results

KPFM का उपयोग करते हुए सपा को मापने की क्षमता नमूना की सतह और ब्रैकट टिप दोनों कुछ हद तक प्रवाहकीय हैं कि सिद्धांत पर निर्भर करता है। स्टेनलेस स्टील और सोने मरसा जुड़े थे जो करने के लिए के रूप में प्रवाहकी?…

Discussion

KPFM सतह विद्युत डेटा प्राप्त करने के लिए एक उपन्यास तकनीक के रूप में नियुक्त किया गया था। यह आमतौर पर रसायन शास्त्र में प्रभारी वितरण की जांच के लिए एक विधि के रूप में इस्तेमाल किया गया है और हाल ही में मा?…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
5500ILM Atomic Force Microscope	Agilent Technologies	#N9435S
AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16219	Stainless steel sample discs
DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes	Mikromasch	#HQ:DPE-XSC11	There are 4 Pt-coated cantilevers per chip.  We utilized cantilever B for experiments.
PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16218-G	Gold sample discs
PicoView Software	Agilent Technologies	#N9797B	5500ILM Atomic Force Microscope imaging software
Pico Image Software (Pico Image Basic)	Agilent Technologies	#N9797AU-1FP	5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software
Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge	Thomas Scientific	#91201513	Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media
Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood	BD	#221261	Pre-made plates
Tryptic Soy Broth	BD	#257107	Comes as a dry powder.  Instruction on how to make come on the container.