켈빈 프로브 힘 현미경을 사용하여 박테리아의 표면 전위 측정

Summary

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Abstract

표면 전위는 기판 표면 위해 미생물의 밀착성 지배적 역할을 간과 물리적 특성이다. 켈빈 프로브 현미경 (KPFM)는 나노 스케일에서 표면 사이의 접촉 전위차를 측정하는 원자 힘 현미경 (AFM)의 모듈이다. AFM KPFM와의 조합은, 표면 전위와 같은 박테리아 세포와 같은 생물학적 샘플의 지형도의 동시 생성을 허용한다. 여기서, 우리는 스테인레스 스틸과 같은 의학적으로 중요한 금 표면에 부착 미생물 표면 전위의 영향을 조사하기 KPFM를 이용한다. 표면 잠재적 인지도는 다른 재료 기판에 미생물 막에 대한 표면 전위의 차이를 한 것으로 밝혀졌습니다. 스텝 높이 그래프는 기판 표면과 미생물 사이의 경계 부분에서의 표면 전위의 차이를 표시하기 위해 생성 하였다. 세포막 표면 전위의 변화는 변화와 연결되어있다세포 대사 및 운동성의. 따라서 KPFM 각종 기재 표면에 접착시 미생물 막 표면 전위의 변화를 조사하기 위해 사용될 수있는 강력한 도구를 나타낸다. 본 연구에서, 우리는를 사용 KPFM 스테인리스 스틸 및 골드 개별 메티 실린 내성 황색 포도상 구균 USA100 세포의 표면 전위를 특성화하는 과정을 보여준다.

Introduction

바이오 필름이 제거에 완강히 저항하고 질병 전송 및 항생제 내성의 증가 속도로 이어질 수있는 장비 표면과 피부 상처에서 생산되는 바이오 필름은 의료 산업에 대한 문제를 제시한다. 첨부 biofilm 형성의 첫 단계와 가역성 ^1-3로 인해 가장 중요한 단계이다. 기판 표면 특성을 미생물에 부착 중요한 역할을한다. 이러한 표면 경도, 다공도, 조도 및 소수성과 같은 인자가 미생물 부착을 행하도록 도시되​​었다; 그러나, 미생물의 부착 기판 표면 전위 (SP)의 역할을 조사 연구는 거의 ^4,5 행해졌 다. 음으로 대전 된 표면은 운모, 실리콘, 및 금 ⁶ 바실러스 투 린지 엔시스 포자의 부착을 방지 할 수 있습니다. 세포막 전위의 변화는 세포 부착과 운동성 ^5,7의 변화를 나타낸다. 그것은 전기 동음 것으로 확인되었습니다ogeneous 표면은 더 쉽게 미생물 부착 ^5를 촉진한다. 나노 스케일에서 박테리아의 표면 전위를 특성화하는 항 생물 연료 전략의 개발에 도움이 될 수있다하여 각종 세균의 표면에 부착 동역학을 이해하는 신규 한 방법을 제공하고있다. 이러한 전기 영동 광 산란, 제타 전위 및 등전점 결정 박테리아의 전기 역학을 특성화에 사용되는 다른 방법과는 달리, 켈빈 프로브 현미경 (KPFM)는 각각의 세포 대신 전체 문화 ^8-11의 시험을 허용한다. 셀 – 셀 비교하거나 높은 정확도 및 정밀도와 전기적 특성을 생물막하고자 할 때 유용하다.

KPFM은 원자력 현미경 (AFM)의 모듈이다. AFM은 스캐닝 터널링 현미경 (STM) ^(12)의 직접적인 결과로서 개발되었다. STM을 사용하여 첫 번째 게시 된 이미지 1982 년 ¹² 게르트 Binnig와 하인리히 Rorhrer에 의해 수행되었다 </suP>. 이들의 발명은 공기에 전도성 표면에 날카로운 전도성 팁을 스캔 래스터에 의해 원자 구조를 해결 할 수 있었다. 화상 신속 건조 DNA, 단백질 샘플 및 바이러스 ¹² STM을 사용하려고 생물학 여기 고해상도 이미지를 달성 의미. STM은 전문 프로브 팁 ^(13)를 사용하여 액체에서 수행 할 수 있습니다. 이 린제이 등., 금 전극 ^(13)에, 10 mM의 HClO ₄ 물에 이미지 DNA 분자 STM과 AFM을 사용하여 표시 하였다. KPFM 리간드 ^(26)와 DNA 및 단백질 분석 ^(25)와 생체 분자 상호 작용의 표면 전위를 결정 증명되었다.

KPFM는 AFM 도전 캔틸레버 팁과 이상적으로 도전 샘플 사이의 접촉 전위차 (CPD)를 측정하여 ^{14, 15} (, 내가 그림 1)를 운영하고 있습니다. 샘플은 반드시 도전 (즉, 생물학적 SAMPL 될 필요가 없습니다ES). 이미징 운모, 유리, 및 긴 비 – 전도성 표면이 얇고 ^-6,7- 밑바탕 도전 ^재료가 실리콘 표면으로 (비 도통)에서 수행 될 수있다. CPD는 표면 전위와 동등한 전압과 음의 전자 전하로 나눈 팁 _(팁 φ) 및 샘플 _(샘플 φ) 간의 일 함수의 차이로서 설명 될 수있다 (- E). 도전성 AFM 팁이 샘플 표면에 근접하게되면 때문에 페르미 에너지에서의 차이 (도 1, II, a) ^(15)에 정전 기적 ​​힘 (F의 _ES)가 생성된다 (거리 (d)에 의해 분리). 이 시점에서, 팁 및 샘플 (E의 _V)의 진공 에너지 평형으로 정렬된다. 가까운 시료 표면에 팁을 가져시, 팁과 시료 표면은 평행 판 커패시터 (도 1, II, B 등의 전기 접점과 행위에 와서 </strong>) ^{(14, 15).} 이때, 팁과 시료 표면의 페르미 에너지는 정상 상태 평형에 도달 정렬 될 (도 1, II, b). 팁과 시료 표면으로 인해 E의 _V의 작업 기능의 차이로 청구됩니다 및 V의 _CPD가 형성됩니다. 인해 형성된 V의 _CPD에 전기 콘택트 영역에서 F _ES가 작용한다. 이 힘은 이후에 (도 1, II, c) 형성된 V의 _CPD와 동일한 크기를 갖는 선단에 외부의 _DC V의인가를 통해 무효화된다. 이는 DC 전압이 전기 접점의 영역에서 표면 전하를 제거 도포하고, V의 _CPD의 F의 _ES를 제거하는 데 필요한 V _DC의 양은 SA 간의 일 함수의 차이와 같다mple 표면과 팁 ^(15). 이것은 팁의 일 함수가 공지되어 있고, 그것은 제조자에 의해 제공된다는 것을 주목해야한다. KPFM 모든 방법에서, AC 전압 (V _AC, 약 100-500 MV)는 또한 팁과 시료 ⁽¹⁴⁾ 사이의 진동 전기력을 발생하기 위해 팁에인가된다. V의 _CPD 및 / 또는 F _말이지의 변화를 측정 할 때 더 나은 해상도를 제공합니다. 이와 관련하여, 주파수 또는 전기적 진동의 진폭의 변화는 V _DC에 의해 보정하고, 전위 맵을 생성 할 수있는 표면 일 수있다. 이지도의 특정 영역의 데이터는 상기 특정 지형은 대한 전기적 정보를 제공하도록 분석 될 수있다.

(1) 리프트 모드, (2), 진폭 변조 (AM) 모드, 및 (3)의 주파수 변조 (FM) 모드 ^14,16 : KPFM 세 가지 모드에서 동작 할 수있다. 리프트 모드 초기 INC이었다KPFM의 arnation. 리프트 모드 발진 팁 지형 화상을 얻을 표면을 가로 질러 드래그하는 두 단계 방법에 의존한다. 두 번째 패스 팁을위한 샘플 상기 미리 설정된 거리 상승 (10-100 나노 미터) 다시 같은 지역에서 검색합니다. 때문에 AM- 및 FM-KPFM에 비해이 두 단계 방법, 리프트 모드로, 이미지 수집에 대한 가장 긴 시간이 소요됩니다. 멀리 표면으로부터 팁을 올리면 만 장거리 F _{말이지 측정되는} 것을 보장한다. 또한, 지형과 표면 전위 측정 사이의 크로스 토크가 증가 측면 해상도와 감도의 비용으로 분리된다.

AM-KPFM 동시에 샘플 지형 및 표면 전위 (일회 주사) ^(14)를 측정하기 위해 듀얼 주파수를 이용하여 가로 해상도와 감도를 향상시킨다. AM 모드에서, 캔틸레버를 기계적 통상 5 %의 제 1 공진 주파수 이하, 발진 (F _0), 전기적 진동 (t두 번째 공진 주파수 (F _1)에서 V _AC) hrough. F에 의한 _ES 및 V의 변화에 _CPD F _(1)의 진폭의 변화는, 표면 전위의 측정 데이터를 제공하면서 지형 데이터의 생성 F ₀ 리드의 진폭의 변화. F _0과 캔틸레버의 F _하나는 크로스 토크가 최소화된다 ⁽¹⁴⁾ 신호 및 상당한 주파수 에너지에 의해 분리된다. AFM의 머리 전자 상자 (HEB)는 모두 지형을 제공하고 한 번의 스캔에서 동시에 잠재적 인 데이터를 표면에 두 개의 신호를 분리한다. FM-KPFM 생물학적 표면 ^(14)에 해상도도 더 이상 AM-KPFM을 향상시킨다. FM-KPFM는 정전기력 구배가 아닌 정전기 힘 (F _말이지) ^(15)의 변화를 측정하는 것을에서 AM-KPFM 다르게 작동합니다. AM 모드와 마찬가지로, FM 모드는 듀얼 주파수와 자장을 이용하여전자 통과 주사기구는 지형적 구하는 동시에 잠재적 인 데이터 ^(14)를 표면. FM 모드에서 외팔보 기계적 F _0으로 진동 전기적 낮은 주파수에서 발진하는 수정 _(MOD F 전형적 1-5 kHz로). 정전 기적 ​​상호 작용시, _0와 f _모드 믹스 f를 ₀ ± F 형 _모드 F 측 대역을 생성한다. 이러한 측 파대 정전기력의 변화에 매우 민감하고, AFM의 HEB 통해 F _{0으로부터} 분리 될 수있다. FM-KPFM는 정전기력 구배의 변화를 측정하기 때문에, 팁 선단 형상 및 그 유지 보수 / 무결성. 전체 표면 전위 해상도 ^{(14), (15)에서} 중요한 역할을 AM을 사용하여 잠재적 인 해상도를 표면 및 FM 모드는 횡 방향으로 1 nm 범위의 ¹⁴ 아르 ^-16. 그것은 KPFM 촬상에가 (비 – 극성 액체에서 수행 될 수 있고, 최근에, 저 이온 (<10 mM)을 극성 액체에서 수행되는 것으로 도시되어 있음을 주목해야한다그러한 한 MilliQ 물로서 DC 바이어스의인가를 미연에 방지, 바이어스 피드백을 필요로하지 않는 개방 루프 KPFM 모드); 그러나, KPFM 영상은 아직 극성 솔루션 ^17-20에서 살아있는 세포에서 수행되어야한다. 액체에 SP 영상과 관련된 추가 과제 솔루션은 일반적으로 유지하는 세포에 사용되는 (즉, 인산염 완충 생리 식염수) 패러데이 반응, 바이어스 유도 충전 역학, 이온 확산 / 재배포 ^(20)로 이어질 것 모바일 이온의 높은 농도를 가지고있다. 따라서,이 실험에서, 측정은 주위 조건 하에서 폴리 -L- 라이신 관능 스테인리스 스틸 및 금 표면 상에 건조시키고, MRSA 죽은 세포로부터 취해졌다. 이미지는 이전에 건조 또는 표면 ^(20)에 고정 된 생체 시료에 공기 또는 진공 상태에서 수행 할 수있다. 습한 환경은 표면 ^(6)의 촬상 KPFM에 영향을 미치는 것으로 나타났다.

이 연구에서는 FM-KPFM 고용AFM은 및 폴리 -L- 라이신 관능 스테인리스 금 표면에 메티 실린 내성 황색 포도상 구균 USA100 (MRSA)의 부착에 SP의 역할을 조사한다. MRSA는 최근 인해 다수의 β – 락탐 항생제와 세 팔로 스포린 ^(21)에 자사의 자연 선택 저항에 다제 내성 (MDR) "슈퍼 벌레"등의 상태를 얻고있다. MRSA 감염은 반코마이신 또는 장기간 치료 ^(22)로서 사용될 수 없다 따라서 인간에서 높은 독성 수준을 가지며, 옥사 졸리 디논 등의 가혹한 항균제의 사용에 이르는 지금 치료하기 더 어려운 곤란하고 강력하다. 스테인레스 스틸은 자사의 의료 관련성과 골드 비교 금속으로 사용되었다 등 피하 주사 바늘, bedpans, 문 손잡이, 싱크대,의 재료로 많이 사용으로 인해 선택되었다. FM-KPFM 미생물 막 SP가 기판에 부착시 변경되는 경우 검사를 사용 하였다.

Protocol

유리와 문화 1. 준비 이 실험을 진행하기 전에, 5 %의 양의 혈액 한천 (SBA) MRSA 성장에 대 한 번호판을 준비합니다. 37 ° C에서 24 시간 동안 SBA 판을 품어. 이 시간이 지나면, 단일, 잘 절연 식민지 액체 미디어에 이후의 예방 접종에 사용되는 존재해야한다. 2 개월 – 스토어 1 4 ° C에서 단일 콜로니와 SBA 판을 줄무늬. 참고 : 양의 혈액 한천 플레이트 (20) 사이에 들어있는 미리 만들어진 팩?…

Representative Results

KPFM를 이용하여 SP를 측정하는 능력은 시료 표면과 캔틸레버 팁 모두 어느 정도 도전성 있다는 원리에 의존한다. 스테인레스 스틸과 골드는 MRSA가 부착 된에 전도성 표면을 행동했다. KPFM 이미지는 512 X 512 해상도 양면에 15 MRSA 세포의 촬영, 5 × 5 μm의 10 × 10 μm의 범위 스캔 영역으로 하였다. 스캔 라인은 0.02 / 초 내지 0.05 줄 / 초의 범위의 선 속도로 행했다. 512 데이터 포인트는 스캔 라인과 512 라인…

Discussion

KPFM 표면 전기적인 데이터를 획득하기위한 신규 한 기술로서 채택되었다. 그것은 일반적으로 화학 전하 분포를 조사하기위한 방법으로 사용되었으며, 최근 마이크로 및 나노 비늘 생물학적 시스템의 연구에 적용되기 시작했다. 수집 된 데이터에서 우리는 미생물이 쉽게 심지어 정적 배양 3 시간 후, 스테인레스 스틸과 금 표면을 청소하는 연결을하지 않은 것으로 보입니다 것으로 나타났습니다. …

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
5500ILM Atomic Force Microscope	Agilent Technologies	#N9435S
AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16219	Stainless steel sample discs
DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes	Mikromasch	#HQ:DPE-XSC11	There are 4 Pt-coated cantilevers per chip.  We utilized cantilever B for experiments.
PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16218-G	Gold sample discs
PicoView Software	Agilent Technologies	#N9797B	5500ILM Atomic Force Microscope imaging software
Pico Image Software (Pico Image Basic)	Agilent Technologies	#N9797AU-1FP	5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software
Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge	Thomas Scientific	#91201513	Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media
Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood	BD	#221261	Pre-made plates
Tryptic Soy Broth	BD	#257107	Comes as a dry powder.  Instruction on how to make come on the container.