Kelvin Probe Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Bakterilerin Yüzey Potansiyel Ölçümü
Summary
Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.
Abstract
Yüzey potansiyel yüzeyleri alt tabakaya mikroorganizmaların yapışmasında bir rol oynayan bir yaygın olarak gözardı edilen fiziksel özelliğidir. Kelvin prob kuvvet mikroskobu (KPFM) nano-ölçekte yüzeyler arasındaki temas potansiyeli farkı ölçen atomik kuvvet mikroskobu (AFM) bir modül. AFM ile KPFM kombinasyonu yüzey potansiyeli ve örneğin bakteriyel hücreler gibi biyolojik örneklerin topografik haritaları aynı anda oluşturulmasına izin verir. Burada, biz böyle paslanmaz çelik ve altın gibi tıbben ilgili yüzeylere yapışma mikrobiyal yüzey potansiyelinin etkilerini incelemek için KPFM istihdam. Yüzey potansiyel haritalar farklı malzeme yüzeylere mikrobiyal membranların yüzey potansiyeli ortaya çıkmıştır. Bir adım yükseklik grafiği substrat yüzeyi ve mikroorganizmalar arasındaki sınır bölgede yüzey potansiyeli farkı göstermek için üretildi. Hücre zarı yüzeyi potansiyelindeki değişim değişim ile bağlantılı olmuşturhücre metabolizması ve hareketlilik s. Bu nedenle, KPFM çeşitli alt-tabaka yüzeyine yapışmasından sonra mikrobiyal zar yüzeyi potansiyeli değişiklikleri incelemek için kullanılabilir güçlü bir araç oluşturmaktadır. Bu çalışmada, KPFM kullanılması ile paslanmaz çelikten ve altın bireysel metisilin dirençli Staphylococcus aureus USA100 hücre yüzey potansiyelini karakterize etmek için prosedürü gösterir.
Introduction
Biyofilm kaldırılması için inatçı ve hastalık bulaşma ve antimikrobiyal direnç oranlarının artışı yol gibi ekipman yüzeylerinde ve deri yaraları üretilen Biyofilmler medikal sektörü için bir sorun mevcut. Ek biyofilm oluşumunda ilk adım olduğunu ve onun tersinirliği 1-3 dolayı en kritik adımdır. Yüzey yüzey özellikleri mikrobiyal eki çok önemli bir rol oynamaktadır. Bu tür yüzey sertliği, gözeneklilik, pürüzlülük ve hidrofobiklik gibi faktörler mikrobiyal ek gerçekleştirilmesi gösterilmiştir; Ancak, mikrobiyal yapışma üzerinde yüzey yüzey potansiyeli (SP) rolünü inceleyen çok az araştırma 4,5 yapılmıştır. Negatif yüklü yüzeyleri mika, silikon, ve altın 6 Bacillus thuringiensis sporlarının bağlanmasını önledikleri varsayılır. Hücre zarı potansiyelinde değişiklikler hücre bağlanması ve hareket kabiliyeti 5,7 değişim göstergesidir. Bu elektrik Hom gözlemlenmiştirogeneous yüzeyler daha kolay bir şekilde mikrobiyal yapışma 5 destekler. Nano bakteri yüzey potansiyelini karakterize, anti-biyolojik kirlilik stratejilerin geliştirilmesine yardımcı olabilir böylece çeşitli yüzeylere bakteri yapışma kinetiği anlamak için yeni bir yol sağlar, ve olabilir. Böyle elektroforetik ışık saçılması, zeta potansiyeli ve izoelektrik nokta belirleme gibi bakteri, elektro kinetik tanımlamak için kullanılan diğer yöntemlerin aksine, Kelvin prob kuvvet mikroskobu (KPFM) tek tek hücrelerin yerine tüm kültürlerin 8-11 incelenmesi için izin verir. Hücre-hücre karşılaştırmak veya yüksek doğruluk ve hassasiyet ile elektriksel özelliklerini biyofilm isteyen bu faydalıdır.
KPFM atomik kuvvet mikroskobu (AFM) bir modül. AFM tarama tünelleme mikroskobu (TTM) 12 doğrudan bir sonucu olarak geliştirilmiştir. STM kullanarak ilk yayınlanan görüntüleri 1982 12 Gerd Binnig ve Heinrich Rorhrer tarafından yapılmıştır </sus>. Onların buluş havada bir iletken yüzey üzerinde keskin bir iletken ucu tarayarak raster tarafından atom yapılarını çözmek başardı. hızlı görüntü kurutulmuş DNA, protein örneklerinin ve virüslere 12 STM kullanmayı denedi biyologları heyecanlı yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etkileri. STM ayrıca özel prob ipuçları 13 kullanılarak sıvı yapılabilir. Bu Lindsay ve ark., Altın elektrotlar 13, 10 mM HClO4 ve su içinde görüntü DNA molekülleri STM ve AFM kullanılan ile gösterilmiştir. KPFM ligandları 26, DNA ve protein analizi 25 ve biyomoleküllerin etkileşim yüzey potansiyellerinin belirlenmesinde gösterilmiştir.
KPFM AFM iletken konsol ucu ve bir ideal olarak iletken numune arasındaki temas potansiyeli farkı (CPD) ölçerek 14,15 (i Şekil 1) çalışır. Numuneler mutlaka iletken (yani, biyolojik sampl olmak zorunda değilsinizes). Görüntüleme mika, cam ve uzun iletken olmayan yüzey incedir ve bir alt iletken malzeme 6,7 olduğu gibi silikon yüzeyler (iletken olmayan) ile gerçekleştirilebilir. SMG yüzeyi potansiyel gerilimi eşdeğerdir ve negatif elektron yükünün bölü ucu (φ ucu) ve örnek (numune φ) arasındaki iş fonksiyonları farkı olarak tarif edilebilir (- e). İletken bir AFM ucu bir örnek, yüzeye yakın getirildiğinde bağlı Fermi enerjileri arasındaki fark (Şekil 1, II, a) 15 ile bir elektrostatik kuvvet (F lar) oluşturulur, (d mesafesinde ayrılmış). Bu noktada, uç ve örnek (E v) vakum enerjileri denge ve hizalanmış bulunmaktadır. Yakın örnek yüzeyine ucu getirerek üzerine, uç ve örnek yüzeyi paralel plakalı kapasitörler (Şekil 1, ii b gibi elektrik kontağı ve hareket girer </strong>) 14,15. Noktada uç ve numune yüzeyinden Fermi enerjileri bir kalıcı-hal dengeye ulaşması aynı hizaya gelirler ve (Şekil 1, ü, b). ucu ve örnek yüzeyi nedeniyle E v 'nin ve iş fonksiyonları bir fark tahsil edilecektir ve V SMG oluşturacaktır. Nedeniyle oluşan V CPD elektrik temas alanı üzerinde bir F es görür. Bu kuvvet daha sonra (Şekil 1, II, c) oluşan V CPD ile aynı büyüklüğe sahip ucuna bir dış V DC uygulaması ile etkisiz kılınır. Bu DC gerilim elektrik temas alanında yüzey yükü ortadan kaldırır uygulanan ve V CPD F es ortadan kaldırmak için gerekli V DC miktarı sa arasındaki iş fonksiyonları farka eşittirmple yüzey ve uç 15. Bu ucu iş fonksiyonu bilinen ve üretici tarafından sağlanan not edilmelidir. Tüm KPFM yöntemlerinde, bir AC voltajı (V AC, yaklaşık 100-500 mV) de uç ve örnek 14 arasındaki salınım elektrik kuvvetlerinin üretilmesi için, uç uygulanır. V CPD ve / veya F es değişiklikleri ölçerken daha iyi çözünürlük sağlar. Bu bağlamda, frekans veya elektrik salınım amplitüdünün değişiklikler V DC ile düzeltilir ve potansiyel harita oluşturulabilir yüzey olabilir. Bu haritaların belirli alanlarda elde edilen veriler daha spesifik topografik özellikler hakkında bilgi sağlamak için elektrik analiz edilebilir.
(1) kaldırma modu, (2) genlik modülasyonu (AM) modu, ve (3) frekans modülasyonu (FM) modu 14,16: KPFM üç modda çalıştırılabilir. Asansör modu ilk inc olduKPFM ve arnation. Asansör modu sallanmaktadır ucu topografik görüntü elde etmek yüzey boyunca sürüklenen olduğu bir iki-geçişli yöntemine dayanır. İkinci geçişte için ucu numune üzerinde önceden belirlenmiş bir mesafeyi yükseltildiğinde (10-100 nm) ve tekrar aynı alan boyunca taradı. Nedeniyle AM- ve FM-KPFM göre bu iki taramalı yöntemiyle, asansör moduna, görüntü alımı için uzun zaman alır. Yüzeyden ucu Raising sadece uzun menzilli F es ölçülür sağlar. Ayrıca, topografya ve yüzey potansiyel ölçümleri arasındaki çapraz konuşma artan yanal çözünürlük ve hassasiyet pahasına decoupled.
AM-KPFM aynı anda numune topografya ve yüzey potansiyeli (tek-geçişli tarama) 14 ölçmek için çift frekansları kullanılarak yanal çözünürlük ve hassasiyeti artırır. AM modunda ise, konsol mekanik genel olarak% 5, ilk rezonans frekansı altında salınım (f 0), ve elektrik olarak salınım (tikinci rezonans frekansı (f 1) bir V AC) hrough. Nedeniyle F es ve V CPD değişikliklere f 1 genlik değişiklikleri, yüzey potansiyel ölçüm verileri verirken topoğrafik verilerin nesil f 0 kurşun genlik değişiklikler. fnin 0 ve konsol f 1 çapraz konuşma 14 en aza indirilir sinyal önemli frekansları ve enerji ile ayrılır. AFM başkanı elektroniği kutusu (HEB) hem topografik vermek ve bir tarama aynı anda potansiyel verileri yüzey iki sinyalleri ayırır. FM-KPFM biyolojik yüzeyler 14 çözünürlük daha fazla AM-KPFM geliştirir. FM-KPFM elektrostatik kuvvet geçişlerini yerine elektrostatik kuvvet (F es) 15 değişiklikleri ölçen AM-KPFM daha farklı çalışır. AM modunda gibi, FM modu çift frekansları ve SINGL kullanırE-pass tarama mekanizması topografik elde etmek ve aynı anda 14 potansiyel verileri yüzey. FM modunda, konsol mekanik f 0 sallanmaktadır ve elektriksel düşük modifiye frekansta salınımlandırılan (mod f, tipik 1-5 kHz). Elektrostatik etkileşimler üzerine, 0 ve f mod karışımı f 0 ± f mod f yan bantları üretimi için. Bu yan bantlar elektrostatik kuvvet değişikliklere çok hassastırlar ve AFM HEB yoluyla f 0 ayrılabilir. FM-KPFM elektrostatik kuvvet geçişlerini değişiklikleri ölçen bu yana, ipuçları apeks şekil ve bakım / bütünlük. Genel yüzeye potansiyel çözünürlük 14, 15 kritik rol oynamaktadır AM kullanarak potansiyel çözünürlük Yüzey ve FM modları yanal 1 nm aralığında 14 olan -16. Bu KPFM görüntüleme içinde (polar olmayan sıvılar içinde yapılabilir, ve en son olarak, düşük iyonik (<10 mM), polar sıvılar içinde yapılabilir gösterilmiştir unutulmamalıdırBöyle MilliQ su gibi bir DC önyargı uygulama kalmayabilir, bir önyargı geribildirim gerekmez açık döngü KPFM modları); Ancak, KPFM görüntüleme henüz kutup çözümleri 17-20 canlı hücrelerde yapılması gerekir. Sıvı SP görüntüleme ile ilgili daha başka sorunlar çözümler genel olarak muhafaza hücreleri için kullanılan (yani, fosfat tamponlu tuzlu su) Faradaysal reaksiyonları, önyargı kaynaklı yük dinamikleri ve iyon difüzyon / yeniden dağıtma 20 yol açacak mobil iyonlar, yüksek konsantrasyonlarda bulunur. Bu durumda, bu deney için, ölçümler ortam koşullarında poli-L-lisin işlevselleştirilmiş paslanmaz çelik, altın yüzeyleri üzerinde kurutuldu ve ölü MRSA hücrelerden alındı. Görüntüleme önceden kurutulmuş ya da yüzey 20 üzerine immobilize edilmiş biyolojik örnekler üzerinde hava veya vakum koşullarında gerçekleştirilebilir. Nemli koşullar da yüzeyleri 6 KPFM görüntüleme etkilediği gösterilmiştir.
Bu çalışmada, biz FM-KPFM istihdamve AFM poli-L-lizin fonksiyonlandırılmış paslanmaz çelik ve altın yüzeylere metisilin dirençli Staphylococcus aureus USA100 (MRSA) eki SP rolünü incelemek için. MRSA son zamanlarda nedeniyle birçok β-laktam antibiyotikler ve sefalosporinlere 21 olan doğal seçilen direnci bir çok ilaç dirençli (MDR) "Superbug" olarak statüsünü topladı. MRSA enfeksiyonları gibi vankomisin ya da uzun süreli tedavilerde 22 olarak kullanılamaz, bu nedenle, insanlarda daha yüksek toksisite düzeyine sahip ve oksazolidinonların gibi daha sert antimikrobik kullanımına yol açan, hemen tedavi etmek için daha zorlu zordur ve çok büyüktür. Paslanmaz çelik tıbbi alaka ve Altın karşılaştırmalı metal olarak kullanılan vb derialtı iğneler, bedpans, kapı kolları, lavabo, bir malzeme olarak yaygın kullanımı nedeniyle seçildi. FM-KPFM mikrobiyal zar SP yüzeylere eki üzerine değişirse incelemek için kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
KPFM elektriksel yüzey verilerinin elde edilmesi için yeni bir yöntem olarak kullanılmıştır. Genellikle kimyada yük dağılımının incelenmesi için bir yöntem olarak kullanılmaktadır ve sadece yakın zamanda mikro ve nano ölçeklerde biyolojik sistemlerin çalışma için uygulanacak başlamıştır. Toplanan veriler biz mikropların kolayca bile statik inkübasyon 3 saat sonra, paslanmaz çelik ve altın yüzeyleri temizlemek eklemek için görünmedi bulundu. Poli-L-lisin işlevselleştirilmiş yüzeyle…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors sincerely thank the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, the Ontario Ministry of Research and Innovation, and the Canada Foundation for Innovation for funding this study.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 5500ILM Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | #N9435S | |
| AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16219 | Stainless steel sample discs |
| DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes | Mikromasch | #HQ:DPE-XSC11 | There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments. |
| PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16218-G | Gold sample discs |
| PicoView Software | Agilent Technologies | #N9797B | 5500ILM Atomic Force Microscope imaging software |
| Pico Image Software (Pico Image Basic) | Agilent Technologies | #N9797AU-1FP | 5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software |
| Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge | Thomas Scientific | #91201513 | Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | BD | #221261 | Pre-made plates |
| Tryptic Soy Broth | BD | #257107 | Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container. |
Referências
- Seth, A. K., et al. In vivo modeling of biofilm-infected wounds: a review. J. Surg. Research. 178 (1), 330-338 (2012).
- Wolcott, R. D., Ehrlich, G. D. Biofilms and chronic infections. JAMA. 299 (22), 2682-2684 (2008).
- Hoiby, N., et al. The clinical impact of bacterial biofilms. Micro. Infect. 3 (2), 55-65 (2011).
- Zhang, W., Hughes, J., Chen, Y. Impacts of hematite nanoparticle exposure on biomechanical, adhesive, and surface electrical properties of E. coli cells. Appl. Environ. Microbiol. 78 (11), 3905-3915 (2012).
- Lorite, G. S., et al. Surface physicochemical properties at the micro and nano length scales: role on bacterial adhesion and Xylella fastidiosa biofilm development. PLoS One. 8 (9), (2013).
- Lee, I., Chung, E., Kweon, H., Yiacoumi, S., Tsouris, C. Scanning surface potential microscopy of spore adhesion on surfaces. Coll. Surf. Biointer. 92, 271-276 (2012).
- Tsai, C., Hung, H., Liu, C., Chen, Y., Pan, C. Changes in plasma membrane surface potential of PC12 cells as measured by Kelvin probe force microscopy. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Jucker, B. A., Harms, H., Zehnder, A. J. Adhesion of the positively charged bacterium Strenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia 70401 to glass and Teflon. J. Bacteriology. 178 (18), 5472-5479 (1996).
- Soon, R. L., et al. Different surface charge of colistin-susceptible and -resistant Acinetobacter baumannii cells measured with zeta potential as a function of growth phase and colistin treatment. J. Anti. Chemo. 66, 126-133 (2011).
- Tariq, M., Bruijs, C., Kok, J., Krom, B. P. Link between culture zeta potential homogeneity and Ebp in Enterococcus faecalis. Appl. Environ. Microbiol. 78 (7), 2282-2288 (2012).
- Ayala-Torres, C., Hernandez, N., Galeano, A., Novoa-Aponte, L., Soto, C. Zeta potential as a measure of the surface charge of mycobacterial cells. Ann Microbiol. , (2013).
- Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Nanomed. Nanobiotech. 2 (6), 613-634 (2010).
- Lindsay, S. M., et al. Scanning tunneling microscopy and atomic force microscopy studies of biomaterials at a liquid-solid interface. J. Vac. Sci. Technol. 11 (4), 808-815 (1993).
- Moores, B., Hane, F., Eng, L., Leonenko, Z. Kelvin probe force microscopy in application to biomolecular films: frequency modulation, amplitude modulation, and lift mode. Ultramicroscopy. 110 (6), 708-711 (2010).
- Melitz, W., Shen, J., Kummel, A. C., Kelvin Lee, S. probe force microscopy and its application. Surf. Sci. Reports. 66 (1), 1-27 (2011).
- Loppacher, C., et al. FM demodulated Kelvin probe force microscopy for surface photovoltage tracking. Nanotechnology. 16 (3), (2005).
- Domanski, A. L., et al. Kelvin probe force microscopy in nonpolar liquids. Langmuir. 28 (39), 13892-13899 (2012).
- Collins, L., et al. Dual harmonic Kelvin probe force microscopy at the graphene-liquid interface. Appl. Phys. Letters. 104 (13), 133103 (2014).
- Kobayashi, N., Asakawa, H., Fukuma, T. Nanoscale potential measurements in liquid by frequency modulation atomic force microscopy. Rev. Sci. Instru. 81, (2010).
- Collins, L., et al. Probing charge screening dynamics and electrochemical processes at the solid-liquid interface with electrochemical force microscopy. Nature Comm. 5, 2871 (2014).
- Pastar, I., et al. Interactions of methicillin resistant Staphylococcus aureus USA300 and Pseudomonas aeruginosa in polymicrobial wound infection. PLoS One. 8 (2), (2013).
- Brien, D. J., Gould, I. M. Does vancomycin have a future in the treatment of skin infections. Cur. Opin. Infec. Diseas. 27 (2), 146-154 (2014).
- Wang, P., Kinraide, T. B., Zhou, D., Kopittke, P. M., Peijnenburg, W. J. G. M. Plasma membrane surface potential: dual effects upon ion uptake and. 155 (2), 808-820 (2011).
- Gross, M., Cramton, S. E., Gotz, F., Peschel, A. Key role of teichoic acid net charge in Staphylococcus aureus colonization of artificial surfaces. Infect. Immun. 69 (5), 3423-3426 (2001).
- Sinensky, A. M., Belcher, A. M. Label-free and high-resolution protein/DNA nanoarray analysis using Kelvin probe force microscopy. Nat. Nanotechnol. 2, 653-659 (2007).
- Park, J., et al. Single-molecule recognition of biomolecular interaction via kelvin probe force microscopy. ACS Nano. 5 (9), 6981-6990 (2011).
