Трансфекции генов к сфероида клетки на Micropatterned культуры Плиты для генетически модифицированной клеточной трансплантации
Summary
This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.
Abstract
Для улучшения терапевтической эффективности трансплантации клеток, был разработан трансплантации система генетически модифицированных, инъекционных сфероидов. Клеточные сфероиды получают в культуральной системе на micropatterned планшетах, покрытых термочувствительного полимера. Количество сфероидов образуются на пластинах, соответствующие клеточной адгезии областей диаметром 100 мкм, которые регулярно расположенных в виде матрицы двумерной образом, в окружении без липких участков, которые покрыты с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) матрицы. Сфероиды могут быть легко восстановлены в виде жидкой суспензии путем понижения температуры пластин и их структура находится в хорошем состоянии, пропуская их через инъекционных игл с достаточно крупного калибра (более 27 г). Генетическая модификация достигается с помощью оригинальной невирусный носитель гена, Polyplex nanomicelle, который способен введения генов в клетки, не нарушая структуру сфероид с помощью генной трансфекции. Для чопорнойичных гепатоцитов сфероиды, трансфицированные геном люциферазы, экспрессирующих, люциферазы устойчиво получены в трансплантированных животных, наряду с сохраненной функцией гепатоцитов, как указано альбумина выражения. Эта система может быть применена к различным типам клеток, включая мезенхимальных стволовых клеток.
Introduction
Клеточная трансплантация терапия привлекла широкое внимание для лечения различных заболеваний неразрешимыми. Активность и период полураспада биологически активных факторов, которые секретируются трансплантированных клеток необходимы для улучшения терапевтической эффективности системы трансплантации клеток. Генетической модификации клеток перед трансплантацией является полезным технику, чтобы регулировать и управлять клеточные функции, в том числе секреции биологически активных факторов. Важно также, чтобы поддерживать благоприятный микроокружение для клеток для предотвращения гибели клеток или потерю активности клеток. Трехмерная культура (3D) сфероид клеток, в которых клетки к клетке взаимодействия хорошо сохранились, является перспективным для этой цели, например, для улучшения альбумина секрецию первичных гепатоцитов и продвижения нескольких клонов дифференцирование от мезенхимальных стволовых клеток (МСК ) 1-7.
В этом исследовании, новая комбинация система spheroiд культура и трансфекция гена используется в качестве платформы для трансплантации генетически модифицированных клеток. Для создания сфероидами клетки, сфероид система культуры на micropatterned культуры пластин используется. На этих пластин, клеточной адгезии участки диаметром 100 мкм регулярно выстроены в двумерном виде и окружены без липких участков, покрытых матрицей ПЭГ 3. По посева достаточное количество клеток, массивы 3D сфероидов 100 мкм в диаметре образуются соответствующий micropatterned культурном слое.
Сфероиды восстановлены без нарушения их 3D структуры с помощью термочувствительных клеток культуральных планшетах, которые были покрыты термочувствительный полимер, поли (изо-пропилакриламид) (PIPAAm) 8-10. Micropatterned архитектура построена на термочувствительных пластин (изготовленный на заказ). Просто снижение температуры пластин, сфероиды отделен от кровати культуры и дисперсныхд в фосфатном буферном растворе (PBS). Таким образом, большое количество сфероидов с одинаковым размером 100 мкм могут быть получены в виде инъецируемой суспензии.
Рисунок 1. Схематическое изображение системы культуры сфероидов на micropatterned пластины. Генетическое изменение достигается путем трансфекции генов с использованием оригинального невирусный носитель гена, Polyplex nanomicelle. Он состоит из плазмидной ДНК (пДНК) и полиэтиленгликоль (ПЭГ) -polycation блоксополимеров 11. Они имеют характерный ядро-оболочка структуру, состоящую из оболочки ПЭГ и внутреннего ядра конденсированного пДНК, позволяющую безопасное и эффективное внедрение гена в клетках в терапевтических целях 11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию Тхис фигурой.
Рисунок 2. Структура POLYPLEX nanomicelle образованного комплекса нуклеиновых кислот и ПЭГ-блок-сополимеров поликатион. В этом исследовании, основное преимущество этого метода в том, что структура сфероид не нарушается во время трансфекции генов со стороны nanomicelles. После nanomicelle-опосредованной трансфекции крыс сфероидов первичной гепатоцитов, длительное трансгенная экспрессия получается более чем за месяц с непрерывным секреции альбумина из гепатоцитов на уровне, сопоставимым с нетрансфицированных сфероидов 12. Выражение трансген и секреции альбумина из сфероидов также сохраняется после выхода из термочувствительной пластины. Очевидно, что можно смело nanomicelles облегчить введение гена без ухудшения врожденные функции ГПУatocytes. Таким образом, сочетание сфероидных клеток, культивируемых на термочувствительных пластин с micropatterned введение гена с использованием nanomicelles является перспективной платформой для трансплантации генетически модифицированных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе важно поддерживать 3D структуру сфероидов на этапах введения гена и восстановления сфероида. Это имеет важное значение для поддержания благоприятных микросреды для клеток, чтобы избежать гибели клеток или потерю активности клеток. Например, альбумин секреции, предста…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы глубоко ценим доктора Такеши Икея и технический персонал в Toyo Gosei, Токио, Япония для обеспечения термочувствительных micropatterned культуры пластины, а также научные рекомендации. Мы также благодарим г-жу Satomi Огура, г-жа Sae Судзуки, г-Аска Миеси и г-жу Katsue Морий для оказания технической помощи с экспериментами на животных. Эта работа была выполнена при финансовой поддержке в части по ЯОРН KAKENHI Грант-в-помощь для научных исследований, Центр инноваций (ИСП) Программы и S-инновационной программы от Японии науки и технологий агентства (JST), и ЯОРН core- к основной программе, А. перспективных исследовательских сетей.
Materials
| Pen-Strep-Glut | GIBCO | ||
| Dexamethasone | Wako Pure Chemical Industries | 041-18861 | |
| Nicotinamide | Wako Pure Chemical Industries | 141-01202 | |
| Hank’s buffered salt and L-ascorbic acid 2-phosphate (Asc-2P) | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Human epidermal growth factor (hEGF) | Toyobo | PT10015 | |
| Cell-able multi-well plates | Toyo Gosei | PP-12 | |
| Thermosensitive cell culture plates (Upcell) | CellSeed Inc | The micropatterned architecture is constructed on the thermosensitive plates (custom-built by Toyo Gosei) | |
| Lipid-based transfection reagent (FuGENE HD) | Promega | E2311 | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega | E2810 | |
| pGL4 Luciferase Reporter Vector | Promega | E6651 | |
| pDNA expressing Gaussia luciferase | New England BioLabs | N8082S | |
| Mouse erhthropoietin-expressing vector | Origene | MC208445 | |
| pCAG-GS | Kindly provided by Laboratory for Pluripotent Cell Studies, Center for Developmental Biology, RIKEN | ||
| Escherichia coli DH5α competent cells | Takara | 9057 | |
| Endotoxin-free plasmid DNA purification system | Nippon Genetics | NucleoBond Xtra EF | |
| collagenase | Wako Pure Chemical Industries | 639-00951 | |
| trypsin inhibitor | GIBCO | R-007-100 | |
| Luminometer | Promega | GloMax™ 96 Microplate Luminometer | |
| IVIS Imaging System | Xenogen Corp. | Xenogen IVIS Spectrum in vivo imaging system | |
| blood sample analyzer | Sysmex | pocH-100i Automated Hematology Analyzer |
Referências
- Landry, J., Bernier, D., Ouellet, C., Goyette, R., Marceau, N. Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: histotypic reorganization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activities. J Cell Biol. 101 (3), 914-923 (1985).
- Yuasa, C., Tomita, Y., Shono, M., Ishimura, K., Ichihara, A. Importance of cell aggregation for expression of liver functions and regeneration demonstrated with primary cultured hepatocytes. J Cell Physiol. 156 (3), 522-530 (1993).
- Otsuka, H., et al. Two-dimensional multiarray formation of hepatocyte spheroids on a microfabricated PEG-brush surface. Chembiochem. 5 (6), 850-855 (2004).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Nakasone, Y., Yamamoto, M., Tateishi, T., Otsuka, H. Hepatocyte spheroids underlayered with nonparenchymal cells for biomedical applications. IEICE Transactions on Electronics. E94, 176-180 (2011).
- Nishida, K., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
- Ohashi, K., et al. Engineering functional two- and three-dimensional liver systems in vivo using hepatic tissue sheets. Nat Med. 13 (7), 880-885 (2007).
- Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Eng Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Itaka, K., Kataoka, K. Progress and prospects of polyplex nanomicelles for plasmid DNA delivery. Curr Gene Ther. 11 (6), 457-465 (2011).
- Endo, T., Itaka, K., Shioyama, M., Uchida, S., Kataoka, K. Gene transfection to spheroid culture system on micropatterned culture plate by polyplex nanomicelle: a novel platform of genetically-modified cell transplantation. Drug Deliv and Transl Res. 2 (5), 398-405 (2012).
- Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J Cell Biol. 43 (3), 506-520 (1969).
- Tateno, C., Yoshizato, K. Long-term cultivation of adult rat hepatocytes that undergo multiple cell divisions and express normal parenchymal phenotypes. Am J Pathol. 148 (2), 383-392 (1996).
- Kanayama, N., et al. A PEG-based biocompatible block catiomer with high buffering capacity for the construction of polyplex micelles showing efficient gene transfer toward primary cells. ChemMedChem. 1 (4), 439-444 (2006).
- Itaka, K., Ishii, T., Hasegawa, Y., Kataoka, K. Biodegradable polyamino acid-based polycations as safe and effective gene carrier minimizing cumulative toxicity. Biomaterials. 31 (13), 3707-3714 (2010).
- Uchida, S., et al. PEGylated Polyplex With Optimized PEG Shielding Enhances Gene Introduction in Lungs by Minimizing Inflammatory Responses. Mol Ther. 20 (6), 1196-1203 (2012).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34, 39-43 (2005).
- Uchida, S., et al. An injectable spheroid system with genetic modification for cell transplantation therapy. Biomaterials. 35 (8), 2499-2506 (2014).
