The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.
الأساليب التقليدية للتلاعب التجريبية من الطحالب قد استخدمت كميات كبيرة من الثقافة (20 مل إلى 5 L)، بحيث يمكن subsampled الثقافة في كافة مراحل التجربة 1-7. الاختزال كميات كبيرة يمكن أن يكون مشكلة لعدة أسباب: 1) أنه يسبب التغير في إجمالي حجم ومساحة السطح: نسبة حجم من الثقافة خلال التجربة. 2) الزائفة التكرار (أي تكرار عينات من نفس المعاملة قارورة 8) وغالبا ما يعملون بدلا من مكررات الحقيقية (أي أخذ العينات من العلاجات تكرار)؛ 3) مدة التجربة محدودة على مجموع الحجم؛ و4) الثقافات ممحوضة أو الجراثيم البكتيرية المعتادة هي صعبة للحفاظ خلال تجارب طويلة الأمد كما يحدث عادة خلال تلوث الاختزال.
استخدام لوحات عيار مكروي تمكن 1 مجلدات ثقافة مل لاستخدامها في كل تكرار، مع ما يصل إلى 48 العلاجات منفصلة داخلوسم لوحة 12.65 X 8.5 × 2.2، مما يقلل من حجم التجريبية والسماح للنسخ المتماثل واسعة دون الاختزال أي علاج. بالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية يمكن تعديلها لتناسب مجموعة متنوعة من الأشكال التجريبية من بينها: البكتيري-الطحالب المشترك الثقافات، والاختبارات الطحالب علم وظائف الأعضاء، والسم فحص 9-11. الآبار الفردية مع طحلب، بكتيريا و / أو زملاء الثقافات يمكن أخذ عينات للعديد من الإجراءات المخبرية بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر: WATER-نبض السعة التضمين (WATER-PAM) التألق، المجهري، مستعمرة بكتيرية تشكيل وحدة (وت) التهم والتدفق الخلوي. مزيج من شكل وحة microtiter وWATER-PAM التألق يسمح للقياسات السريعة متعددة من العائد الضوئي والمعلمات الضوئية الأخرى مع تقلب منخفض بين العينات، استنساخ عالية ويتجنب الكثير من المزالق من الاختزال والدامجانة زجاجة أو قارورة مخروطي الشكل على مدار التجربة .
وقد جرت العادة على درس علم وظائف الأعضاء العوالق النباتية في التجارب المتوسط على نطاق واسع من 20 مل في قوارير المخروطية إلى 5 لتر في قوارير 1-7. هذا على نطاق تجريبي يتطلب الاختزال لرصد التجريبي، كما التضحية عينات تكرار لكل نقطة زمنية يخلق الإعداد التجريبية لا يمكن السيطرة عليها.
القدرة على زيادة عدد تجارب مستقلة أثناء استخدام نفس المساحة حاضنة نهاري من قبل التصغير حجم التجريبي للتجارب فسيولوجيا الطحالب سوف تخفيض أو إزالة القيود المفروضة على الاختزال والزائفة النسخ المتماثل من كميات كبيرة. وقد تم تطوير شكل وحة microtiter لاختبارات بيولوجية الطحالب باستخدام حجم 1 مل الثقافة تجريبيا لمعالجة الطحالب في ظروف متغيرة. يسمح هذا الحجم تجريبي صغير لعدد من مكررات إلى أن زيادة، ويزيد من استنساخ التجربة نظرا لتقلب انخفضت بين العينات تكرار والتجارب، ويسمح للنسخ المتماثل صحيح مع الحفاظ على الضوابط التجريبية (أي والثقافات الطحالب ممحوضة) لمدة 140 يوما (الشكل 2) 12.
ويتم تكييف هذا الشكل وحة microtiter بسهولة لمجموعة متنوعة من الأسئلة التجريبية، مثل: هل يمكن لأي بكتيريا يكون التفاعل التكافلية، محايد أو الممرضة مع مضيفه الطحالب؟ هو إضافة لتحفيز مجمع أو سامة إلى طحلب؟ هذه الأسئلة وغيرها لا يمكن معالجتها بطريقة عالية الإنتاجية السريعة باستخدام هذا الشكل الجديد 9-11.
A 48-جيدا لوحة الثقافة عيار مكروي تتيح لكل 1 مل جيدا ليكون الإعداد التجريبية المستقلة التي تم أخذ عينات في واحدة الوقت نقطة. يمكن أخذ عينات المعلمات المختلفة من هذا المجلد 1 مل بما في ذلك، ولكن لا تقتصر على: مضان الكلوروفيل والمعلمات الضوئية باستخدام WATER-نبض السعة التضمين (WATER-PAM) قياس التألق (انظر المواد والمعدات الجدول) 13. WATER-PAM التألق هو تقنية سريعة وغير الغازية التي يمكن استخدامها لمراقبة التجارب أجريت مع الطحالب 13. وهو يتيح قياس كفاءة التمثيل الضوئي والصحة PSII من حجم صغير الثقافة (150-300 ميكرولتر من ثقافة المخفف في المتوسط إلى 2 – حجم مل 4 لWATER-PAM) 14،15. بالإضافة إلى WATER-PAM التألق، وهذا الإعداد يمكن استخدامها لقياس مجموعة متنوعة من العوامل الأخرى بما في ذلك، ولكن لا تقتصر على: الفحص المجهري لتصور البكتيريا التي تعلق على خلايا الطحالب والتغيرات في مورفولوجيا الخلايا الطحلبية. مستعمرة بكتيرية تشكيل وحدة (وت) التهم الموجهة إليه. والتدفق الخلوي لعدد خلايا الطحالب وتحديد المجموعات السكانية الفرعية.
نمو الطحالب في شكل المنمنمة.
التصغير من الثقافات الطحالب إلى وحدة تخزين الثقافة 1 مل في وحة microtiter يسمح لتكرار ضمن تجربة لتكون زيادة. من المهم لضمان طحلب هو صحي طوال تجربة. إجراء منحنى النمو (الشكل 2)، وذلك باستخدام صيغة وحة mi…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (grant 402105), Canadian Foundation for Innovation (grant 129087) and Alberta Education and Training (grant AAETRCP-12-026-SEG) to RJC.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
10 cu. ft. Diurnal Incubator (6012-1) | Caron Corporate | 112310-6012-1-11 | www.caronproducts.com |
Nunc EasYFlask 25cm2, Vent/Close Cap, 7mL working volume, 200/Cs | Thermo Fisher Scientific | N156340 | www.fishersci.ca |
Multiwell TC Plates – 48 Well | BD Biosciences Discovery Labware | 353078 | www.bdbiosciences.com |
P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F123602 | www.mandel.ca |
P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F161201 | www.mandel.ca |
Wide Orifice Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-468 | www.ca.vwr.com |
Ultrafine Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-470 | www.ca.vwr.com |
Finntip 10mL [Vol: 1-10mL] | Thermo Fisher Scientific | 9402151 | www.fishersci.ca |
WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) | Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany | EDEE0232 | www.walz.com |
15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) | Caron Corporate | www.caronproducts.com | |
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Thermo Fisher Scientific | Thermo Fisher Scientific | www.fishersci.ca |
BD Difco Marine Broth 2216 | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
BD Bacto Agar | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
L1 Medium Kit, 50L | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | www.ncma.bigelow.org |