Küçük Hacim Biyodeneyler SU-Pulse-Genlik Modülasyonlu (SU-PAM) fluorometri Kullanma Bakteriyel / Fitoplankton Co-kültür değerlendirilmesi için
Summary
The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.
Abstract
Kültür deney 1-7 boyunca alt örnekler, böylece mikroalg deneysel manipülasyonu için bilinen metotlar, kültürün büyük miktarda (5 L 20 mi) kullanmıştır. Büyük hacimlerde örnekleme çeşitli nedenlerle sorunlu olabilir: 1) toplam hacmi ve yüzey alanında bir değişime neden olur: deney sırasında kültür hacmi oranına; 2) Sözde çoğaltma (yani, aynı tedavi şişeye 8 örnekleri) genellikle oldukça gerçek çoğaltır (çoğaltmak tedaviler yani, örnekleme) daha kullanılır çoğaltmak; 3) Deney süresi toplam hacmine sınırlıdır; ve 4) aksenik kültürleri ya da her zamanki gibi bakteriyel Mikrobiyota kontaminasyon genel olarak alt-numûne alma sırasında oluşan uzun süreli deneyler sırasında bakımı zordur.
mikrotitrasyon plakaları içinde en fazla 48 ayrı tedaviler ile 1 ml kültür, her için kullanılacak miktarlar çoğaltma etkinleştirirBir 12.65 x 8.5 x 2.2 cm plaka, böylece deneysel hacmi azalan ve herhangi bir tedavi subsampling olmadan geniş çoğaltma için izin. 9-11 tarama bakteriyel-alg ko-kültürler, alg fizyolojisi testleri ve toksin: Ayrıca, bu teknik deneysel olmak üzere çeşitli biçimlerde uyacak şekilde modifiye edilebilir. Bir yosun, bakteri ve / veya ko-kültürler ile bireysel çukurlar bunlarla sınırlı olmamak üzere çok sayıda laboratuar prosedürleri için örneklenmiş ama edilebilir: SU darbe genlik-modülasyonlu (SU-PAM) fluorometri, mikroskopi, bakteri koloni oluşturan birimi (cfu), sayımları ve akım sitometri. mikrotiter plaka formatı ve SU-PAM fluorometri kombinasyonu fotokimyasal verim ve numuneler, yüksek tekrarlanabilirlik arasındaki düşük değişkenlik diğer fotokimyasal parametrelerin birden hızlı ölçümler için izin verir ve bir deney boyunca bir damacananızı veya konik balon subsampling birçok tuzaklar önler .
Introduction
Fitoplankton fizyolojisi geleneksel konik şişelerinde 20 ml lik karboya 1-7 5 L arasında değişen orta-ölçek deneylerinde incelenmiştir. Her zaman noktası için tekrarlanan örnekleri ödün yönetilemez bir deney düzeneği oluşturur gibi bu deneysel ölçek, deneysel izleme Subsampling gerektirir.
azaltmak veya büyük miktarlar subsampling ve sözde çoğaltma sınırlamaları ortadan kaldıracak alg fizyolojisi deneyleri için deney hacmini küçülterek aynı gündüz inkübatör alanını kullanırken yeteneği bağımsız deneyler sayısını artırmak için. Bir mikro-titre plakası biçimi deneysel olarak değişik koşullarda yosun kontrol etmek için bir 1 ml kültür hacmi kullanılarak yosun biyo-deneyler için geliştirilmiştir. Bu küçük hacimli deneysel çoğaltır sayısı artırılmalıdır için, izin verir nedeniyle tekrarlanan numuneler arasında bir azalma değişkenlik deneysel tekrarlanabilirlik artırır(Şekil 2) 12 140 gün boyunca deney kontroller (örneğin, aksenik alg kültürler) muhafaza ederken, deneyler ve gerçek çoğaltma sağlar.
Bu mikrotiter plakası formatında kolayca gibi, deneysel sorular çeşitli uyarlanmıştır: bir bakteri olan alg ev sahibi ile bir, simbiyotik nötr veya patojenik etkileşim var mı? Bir yosun bir bileşik uyarıcı eklenmesi veya toksik mi? Bu ve diğer sorular bu yeni formatı 9-11 kullanarak hızlı, yüksek verimli bir şekilde ele alınabilir.
48-çukurlu mikrotitre kültürü plakası, her biri 1 mi de tek bir zaman noktasında örneklenir bağımsız deney düzeneği olmasını sağlar. Çeşitli parametreler dahil olmak üzere bu 1 ml hacminde örneklenmiş, ancak bunlarla sınırlı olmamak kaydıyla: SU-Pulse-Genlik Modülasyonlu (SU-PAM) fluorometri (Malzemeler ve Ekipmanları tabloya bakınız) 1 kullanarak klorofil floresan ve fotokimyasal parametreler3. SU-PAM fluorometri yosunu 13 ile yapılan deneyler izlemek için kullanılabilecek bir hızlı ve invazif olmayan bir tekniktir. 14,15 (SU-PAM 4 ml hacim – – bir 2 ortamında seyreltilmiş kültür, 300 ul 150), küçük bir kültür hacmi fotosentez verimi ve PSII sağlığı ölçülebilir. SU-PAM fluorometri ek olarak, bu kurulum dahil olmak üzere diğer çeşitli parametreler ölçmek için kullanılabilir, ancak bunlarla sınırlı değildir: alg hücrelerinin ve yosun hücre morfolojisindeki değişiklikler ekli bakteri görselleştirmek için mikroskopi; Birim (cfu) sayısını oluşturan bakteri kolonisi; ve alg hücre sayımı ve belirlenmesi alt popülasyonlar için flow sitometri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir minyatür formatta Alg büyüme.
Bir deney içinde, çoğaltma arttığı bir mikrotiter plakası içinde bir 1 ml kültür hacmi için alg kültürlerin minyatür sağlar. Bu alg bir deney boyunca sağlıklı olmasını sağlamak için önemlidir; alg besin gereksinimleri yerine getirilmesini sağlamak için, çeşitli alg medya değerlendirmek için mikrotiter plaka biçimini kullanarak, bir büyüme eğrisi (Şekil 2) gerçekleştirin. Ayrıca, gün ışığı döngüsü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (grant 402105), Canadian Foundation for Innovation (grant 129087) and Alberta Education and Training (grant AAETRCP-12-026-SEG) to RJC.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10 cu. ft. Diurnal Incubator (6012-1) | Caron Corporate | 112310-6012-1-11 | www.caronproducts.com |
| Nunc EasYFlask 25cm2, Vent/Close Cap, 7mL working volume, 200/Cs | Thermo Fisher Scientific | N156340 | www.fishersci.ca |
| Multiwell TC Plates – 48 Well | BD Biosciences Discovery Labware | 353078 | www.bdbiosciences.com |
| P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F123602 | www.mandel.ca |
| P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F161201 | www.mandel.ca |
| Wide Orifice Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-468 | www.ca.vwr.com |
| Ultrafine Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-470 | www.ca.vwr.com |
| Finntip 10mL [Vol: 1-10mL] | Thermo Fisher Scientific | 9402151 | www.fishersci.ca |
| WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) | Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany | EDEE0232 | www.walz.com |
| 15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) | Caron Corporate | www.caronproducts.com | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Thermo Fisher Scientific | Thermo Fisher Scientific | www.fishersci.ca |
| BD Difco Marine Broth 2216 | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| BD Bacto Agar | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| L1 Medium Kit, 50L | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | www.ncma.bigelow.org |
References
- Scarratt, M. G., Marchetti, A. Assessing microbial responses to iron enrichment in the Subarctic Northeast Pacific: Do microcosms reproduce the in situ condition?. Deep Sea Res Part II Top. Stud. Oceanogr. 53 (20-22), 2182-2200 (2006).
- Bidle, K. D., Haramaty, L., Barcelos E Ramos, J., Falkowski, P. Viral activation and recruitment of metacaspases in the unicellular coccolithophore, Emiliania huxleyi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 6049-6054 (2007).
- Moore, L. R., Goericke, R., Chisholm, S. W. Comparative physiology of Synechococcus and Prochlorococcus: influence of light and temperature on growth, pigments, fluorescence and absorptive. Mar. Ecol. Prog. Ser. 116, (1995).
- Iglesias-Rodriguez, M. D., Halloran, P. R. Phytoplankton calcification in a high-CO2 world. Science. 320 (5874), 336-340 (2008).
- Chen, M., Tang, H., Ma, H., Holland, T. C., Ng, K. Y. S., Salley, S. O. Effect of nutrients on growth and lipid accumulation in the green algae Dunaliella tertiolecta. Bioresour. Technol. 102 (2), 1649-1655 (2011).
- Lv, J. -. M., Cheng, L. -. H., Xu, X. -. H., Zhang, L., Chen, H. -. L. Enhanced lipid production of Chlorella vulgaris by adjustment of cultivation conditions. Bioresour. Technol. 101 (17), 6797-6804 (2010).
- Geider, R., Graziano, L., McKay, R. M. Responses of the photosynthetic apparatus of Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae) to nitrogen and phosphorus limitation. Eur. J. Phycol. 33 (4), 315-332 (1998).
- MacIntyre, H. L., Cullen, J. J. Using Cultures to Investigate the Physiological Ecology of Microalgae. Algal Cult. Tech. , 287-326 (2005).
- Blaise, C., Vasseur, P. Algal microplate toxicity test. Small-scale Freshw. Toxic. Investig. Vol. 1 Toxic. Test Methods. , 137-179 (2005).
- Skjelbred, B., Edvardsen, B., Andersen, T. A high-throughput method for measuring growth and loss rates in microalgal cultures. J. Appl. Phycol. 24, 1589-1599 (2012).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicol. Environ. Saf. 94, 37-44 (2013).
- Seyedsayamdost, M. R., Case, R. J., Kolter, R., Clardy, J. The Jekyll-and-Hyde chemistry of Phaeobacter gallaeciensis. Nat. Chem. 3 (4), 331-335 (2011).
- Schreiber, U., Schliwa, U., Bilger, W. Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer. Photosynth. Res. 10 (1-2), 51-62 (1986).
- Jones, R. J., Ward, S., Amri, A. Y., Hoegh-Guldber, O. Changes in quantum efficiency of photosystem II of symbiotic dinoflagellates of corals after heat stress, and of bleached corals sampled after the 1998 Great Barrier Reef mass bleaching event. Mar. Freshw. Res. 51 (345), 659-668 (1998).
- Beer, S., Larsson, C., Poryan, O., Axelsson, L. Photosynthetic rates of Ulva (Chlorophyta) measured by pulse amplitude modulated fluorometry. Eur. J. Phycol. 35 (1), 69-74 (2000).
- . . WATER-PAM Chlorophyll Fluorometer. Instrument Description and Information for Users. , (2013).
- Maxwell, K., Johnson, G. M., Heers, J. Chlorophyll fluorescence–a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
- Herigstad, B., Hamilton, M., Heersink, J. How to optimize the drop plate method for enumerating bacteria. J. Microbiol. Methods. 44 (2), 121-129 (2001).
- Kooten, O., Snel, J. The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynth. Res. 25 (3), 147-150 (1990).
- Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence–a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
- Schreiber, U. Pulse-Amplitude-Modulation (PAM) Fluorometry and Saturation Pulse Method: An Overview. Chlorophyll a Fluoresc. A Signat. Photosynth. , 279-319 (2004).
- Roháček, K., Barták, M. Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica. 37 (3), 339-363 (1999).
- Da Silva, J. M., da Silva, A. B., Pádua, M. Modulated chlorophyll a fluorescence: a tool for teaching photosynthesis. J. Biol. Educ. 41 (4), 178-183 (2007).
- Vieira, S., Ribeiro, L., Jesus, B., Cartaxana, P., da Silva, J. M. Photosynthesis assessment in microphytobenthos using conventional and imaging pulse amplitude modulation fluorometry. Photochem. Photobiol. 89 (1), 97-102 (2013).
