Bewertung der Zebrafisch Nierenfunktion unter Verwendung einer fluoreszierenden Räumungs Assay
Summary
Der Zebrafisch ist ein beliebtes Tool zur chronischen Nierenerkrankung (CKD) zu modellieren. Allerdings macht ihre geringe Größe es unmöglich, die Nierenfunktion zu bewerten mit traditionellen Methoden. Wir beschreiben einen Fluoreszenzfarbstoff Nieren-Clearance-Test 1, die quantitative Analyse von Zebrafisch Nierenfunktion bei CKD ermöglicht.
Abstract
Die Zebrafischembryo bietet eine praktische Zwecke geeigneten Modells zur Organogenese studieren und modellieren menschliche genetische Erkrankung. Trotz ihrer relativen Einfachheit der Zebrafisch Niere entwickelt und Funktionen in fast der gleichen Weise wie Menschen. Ein Hauptunterschied in der Konstruktion der menschlichen Niere ist die Anwesenheit von Millionen von Nephronen gegenüber dem Zebrafisch, der nur zwei hat. Jedoch vereinfacht eine solche komplexe System in die Grundfunktionseinheiten ist unser Verständnis, wie die Niere entwickelt und betreibt unterstützt. Im Zebrafisch ist der Mittellinie befindet Glomerulus für die erste Blutfiltration in zwei pronephric Tubuli, die beidseitig entlang der embryonalen Achse laufen vor dem Verschmelzen miteinander an der Kloake abweichen verantwortlich. Die pronephric Tubuli sind stark von bewegliche Zilien, die die Bewegung Filtrat entlang der segmentierten Röhrchen zu erleichtern bevölkert, die den Austausch von verschiedenen gelösten Stoffe, bevor sie schließlich Verlassen durch die Kloake 2-4. Viele Gene, die für CKD, inc verantwortlichLuding diejenigen zu ciliogenesis Zusammenhang wurden im Zebrafisch 5 untersucht. Allerdings ist eine große Nachteil ist die Schwierigkeit bei der Beurteilung Zebrabärbling Nierenfunktion nach der Genmanipulation. Traditionelle Assays zu Funktionsstörungen der Nieren messen beim Menschen nicht translationale zu Zebrafisch erwiesen, vor allem wegen ihrer aquatischen Umwelt und der geringen Größe. Beispielsweise ist es physikalisch nicht möglich ist, Blut zu extrahieren aus embryonalen statt Fische zur Analyse von Harnstoff und Kreatinin-Gehalt, da sie zu klein sind. Hinzu kommt, dass Zebrafisch nicht genug Urin produzieren, für die Prüfung auf einem einfachen Proteinurie "Messstab", die oft bei der ersten Untersuchung von Patienten durchgeführt wird. Wir beschreiben einen Assay, der die fluoreszierende optische Transparenz der Zebrafisch verwendet, um den Abstand von einem fluoreszierenden Farbstoff quantitativ zu überwachen, mit der Zeit aus dem Gefäßsystem und durch die Niere, um eine Ausgabe der Nierenfunktion 1,6-9 ergeben.
Introduction
Die menschliche Niere spielt eine entscheidende Rolle bei der Filterung von metabolischen Abfällen aus dem Blut und Gewinnung erforderlich Solute zellulären Homöostase aufrechtzuerhalten. Es gibt eine Reihe von menschlichen genetischen Krankheiten, Funktionsstörungen der Nieren verursachen. Die häufigste vererbte Nierenerkrankung wird autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD), gekennzeichnet durch die Entwicklung von mit Flüssigkeit gefüllten Säckchen im Nieren Tubuli; der Schaden, den cystogenesis verursacht beeinträchtigt die Nierenfunktion 10. ADPKD hat ein Auftreten von 1: 800 bis 1: 1000 und ist für 8 – 10% der Patienten im Endstadium der Niereninsuffizienz (ESRF) 11. Mehrere Gene wurden in Verbindung gebracht zu ADPKD verursachen einschließlich Polycystin-1 (PKD1) und 2 (PKD2), einem Anteil von ca. 85% und 15% der Fälle bzw. 12,13. Ferner können die Genprodukte für PKD1 und -2 zu lokalisieren Ciliums und sind von grundlegender Bedeutung ciliogenesis 14,15. Es gibt nun eine anerkannte Gruppe von menschlichen genetischen Erkrankungen, bekannt alsdie Ziliopathien, die Zilien Funktion beeinträchtigen und zu CKD 16.
Die wachsende Zahl von menschlichen genetischen Erkrankungen ciliary Entwicklung und Funktion zeichnet globale Interesse an dieser einst als verkümmerte Organelle. Die Zilien, eine haarähnliche Zellüberstand wird mit Rezeptoren und Ionenkanäle für die Weiterleitung von wichtigen Zellsignalwege erforderlich bereichert. Die Zilien aus einem Mikrotubuli-basierte Axonem, typischerweise in neun radial angeordnet Mikrotubulus Dubletts mit oder ohne zentralen Paar von Singulett Mikrotubuli strukturiert. Die axonemal Struktur definiert die Art und Weise der ciliary Aktion. Die 9 + 2 Mikrotubuli Anordnung verleiht Motilität Ciliums wo sie bei der Bewegung von Fluiden über epitheliale Oberflächen ausgenutzt. Die 9 + 0-Konfiguration ist nicht beweglich, sondern wird angenommen, dass in erster Linie Funktion in der zellulären Signalwege 17. Abgesehen von CKD, sind die Folgen der ciliary Dysfunktion ein Satz charakteristischerZiliopathie Funktionen, die umfassen, Übergewicht, Netzhautdegeneration, Polydaktylie und kognitive Beeinträchtigung 16. Allerdings ist CKD zu den am meisten nachteilig auf die Lebensqualität des Patienten und damit eine treibende Kraft hinter der Entwicklung geeigneter In-vivo-Modelle für ciliary bezogenen CKD.
Der Zebrafisch ist ein ausgezeichnetes Modell, um die Ätiologie der menschlichen genetischen Krankheit zu verstehen. Ihre schnelle Entwicklung, ermöglicht die Herstellung einer großen Anzahl von Eiern, transparenten Gewebe und ex utero Wachstumszebrafischentwicklungsvorgänge visualisiert werden und biologische Ereignisse mit großer Leichtigkeit manipuliert. Gene können gentechnisch verändert werden, mit dem jüngsten Erfolg der Genom-Editing-Tools (CRISPR 18 und TALENS 19), niedergeschlagen mit Antisense-Morpholino-Technologie 20 oder pharmakologisch durch die Zugabe von Verbindungen, um ihre Gewässer geregelt. In der Tat, Zebrafisch eine Plattform bieten zu unternehmen eXperimente die nicht permissive in anderen Tiermodellen sind. Während Zebrabärbling sind relativ einfach Vertebraten (gegenüber Menschen) sie viele funktionell konservierten Organen, Gene und Signalprozesse gemeinsam mit dem Menschen. Beispielsweise ist die Zebrafisch Niere in Struktur und Funktion bemerkenswert ähnlich im Vergleich zum Menschen 21,22. Im Gegensatz zu der Säugetierniere, die durch eine Folge von Phasen entwickelt, die jeweils durch einen weiter entwickelten Niere (pronephros, mesonephros und Metanephros) gekennzeichnet, entwickelt der embryonalen Zebrabärbling nur pronephros, die meisten unreifen Form einer Niere. Während Millionen von Nephronen zu finden sind, welche die Bausteine der Säugetierniere, nur der Zebrafischembryo besitzt zwei. Die Glomeruli, die für die anfängliche Blutfiltrat zu ermöglichen, sind an der Mittellinie gerade ventral zur Aorta fusioniert. Blutfilter durch die Glomeruli in die pronephric Tubuli, die kaudal laufen entlang der Achse, Absicherung vor über die Kloake zu verlassen. Die pronephric tuBules stark mit motilen Zilien, die permissive zur Strömung des Filtrats nach caudal und Austritts 3,4 sind Flimmerepithel. Diese einfache pronephric Struktur beibehält Zebrafisch-Homöostase durch mehrere Wochen das Larvenwachstum wo sie schließlich in eine komplexere Struktur Mesonephros 21 zu entwickeln. Allerdings entwickelt sich der Zebrafisch nie eine Metanephros 21. Trotz der Zebrafisch-Eigenheiten, ist der Zebrafisch Nephron mit Genexpressionsprofile gleich bei Säugetieren beobachtet segmentiert und bietet so einen unvergleichlichen In-vivo-Modell für Nephrogenese 3,22.
Routine Patienten für die Nierenfunktion durch eine Reihe von Blut- und Urintests geprüft. In der Regel wird das Blut für gelöste Salze, Harnstoff und Kreatinin analysiert. Hohe Konzentrationen von Harnstoff, Kreatinin und abnormalen Salzkonzentrationen weisen auf Probleme mit der Nierenfunktion. Urinanalyse unter Verwendung eines kolorimetrischen Messstab erkennt abnormale Niveaus des Proteins, blood, Eiter, Bakterien und in Urinproben vorhanden Zucker. Solche Tests erfordern normalerweise ca. 30 ml Urin oder 5 – 10 ml der Blut. Es ist schwierig gewesen, diese Art von Assays, um kleine in vivo Modellorganismen wie Zebrafisch zu übersetzen, hauptsächlich aufgrund der Beschaffenheit unmöglich, eine ausreichende Blut oder Urin, um den Assay durchzuführen. Hier wenden wir uns den Mangel an geeigneten Zebrafisch Nierenfunktionstests und beschreibt eine innovative Technik für die Studie. Durch Injizieren eines fluoreszierenden Farbstoffes in dem Blutstrom sind wir in der Lage, über die Nieren zu überwachen und zu quantifizieren, einzeln über die Zeit der Filtration und die Ausscheidung von Fluoreszenzaktivität aus dem Blut. Diese Methode kann verwendet werden, um Nierenschäden aufgrund von Krankheiten, die wir erbringen, ein Beispiel zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafische bieten ein wertvolles Werkzeug für die menschliche genetische Krankheitsmodell, ihre Verwendung als ein wissenschaftliches Instrument zur in vivo Erforschung detaillierte Studien der genetischen Abbau von vielen biologischen Systemen, einschließlich der Niere aktiviert. Viel ist nun, wie die Zebrafisch-Niere entwickelt und Funktionen zu verstehen. Die auffallende Parallelen zum menschlichen Nephrogenese und Homologie mit krankheitsverursachenden Gene 21 hat sich das Verständnis veransc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Technische Unterstützung durch Jaipreet Bharj vorgesehen. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus EU-FP7 (SYSCILIA -241.955) und der niederländischen Kidney Foundation (CP11.18) unterstützt.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller | Intracel | P-97 | |
| borosilicate standard wall capillaries | Harvard Apparatus | 30-0017 | |
| Glass microscope slides | VWR International | 631-0109 | |
| Epoxy Resin Glue | Evo-Stik | ||
| Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran | Life technologies | D-1824 | |
| N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| air compressor | Jun-Air | OF302-15 | |
| Picospritzer III | Parker Instruments | 051-0500-900 | |
| compact 3-axis control micromanipulator | Marzhauser | MM33 | |
| Dissecting stereo microscope | Nikon | SMZ1000 | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Dumont #5 forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| stage micrometer | Pyser- SGI | 02A00404 |
Referências
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