Evaluatie van de zebravis Kidney Functie Met behulp van een TL-Ontruiming Assay
Summary
De zebravis is een populaire tool voor het modelleren chronische nierziekte (CKD). Echter, hun kleine formaat maakt het onmogelijk om de nierfunctie te evalueren met behulp van traditionele methoden. We beschrijven een fluorescerende kleurstof nier speling assay 1 dat kwantitatieve analyse van de zebravis nierfunctie bij CKD maakt.
Abstract
De zebravis embryo biedt een soepel model in organogenese bestuderen en modelleren van de menselijke genetische ziekte. Ondanks zijn relatieve eenvoud, de zebravis nier ontwikkelt en functioneert nagenoeg dezelfde wijze als mensen. Een belangrijk verschil in de constructie van de menselijke nier is de aanwezigheid van miljoenen nefronen opzichte van de zebravis dat slechts twee heeft. Echter, het vereenvoudigen van een dergelijk complex systeem in de elementaire functionele eenheden heeft ons begrip van hoe de nier ontwikkelt en exploiteert geholpen. In de zebravis, de middellijn gelegen glomerulus is verantwoordelijk voor de initiële bloedfiltratie in twee pronephric tubuli die afwijken bilateraal run down de embryonale as vóór het fuseren met elkaar op de cloaca. De pronephric tubuli zijn sterk bevolkt door bewegende cilia dat de beweging van filtraat vergemakkelijken langs de gesegmenteerde tubulus, waardoor de uitwisseling van verschillende opgeloste stoffen voordat ze uiteindelijk verlaten via de cloaca 2-4. Vele genen die verantwoordelijk zijn voor CKD, incLuding die verband houden ciliogenese, zijn onderzocht in zebravis 5. Echter, een belangrijk nadeel moeilijk in cijfers zebravis nierfunctie na genetische manipulatie is. Traditionele assays tot nierstoornissen meten bij mensen niet translationeel te zebravis hebben bewezen, met name als gevolg van hun aquatisch milieu en kleine omvang. Zo is het fysiek onmogelijk om bloed onttrekken embryonale opgevoerd vis voor analyse van ureum en creatinine gehalte, omdat ze te klein. Bovendien sluiten zebravis genoeg produceren urine te testen op een eenvoudige proteïnurie "dipstick", die vaak wordt uitgevoerd tijdens de eerste patiënt onderzoeken. We beschrijven een fluorescentie dat de optische transparantie van de zebravis gebruikt om kwantitatief monitoren de goedkeuring van een fluorescente kleurstof, in de tijd, van de vasculatuur en via de nieren, een read geven nierfunctie 1,6-9.
Introduction
De menselijke nier speelt een cruciale rol in het filteren van metabole afvalstoffen uit het bloed en herstellende nodig opgeloste stoffen om cellulaire homeostase in stand te houden. Er zijn verschillende humane genetische ziekten die nierstoornissen veroorzaken. De meest voorkomende erfelijke nierziekte autosomaal dominante polycystische nierziekte (ADPKD) gekenmerkt door de ontwikkeling van vloeistof gevulde blaasjes in pochechnykh tubuli; schade door cystogenesis schaadt nierfunctie 10. ADPKD heeft een voorkomen van 1: 800-1: 1000 en vertegenwoordigt 8-10% van de patiënten in het eindstadium nierfalen (ESRF) 11. Verschillende genen zijn betrokken bij ADPKD veroorzaken waaronder polycystine-1 (PKD1) en -2 (PKD2), goed voor ongeveer 85% en 15% van de gevallen respectievelijk 12,13. Bovendien is de genproducten voor PKD1 en -2 lokaliseren aan de cilium en zijn fundamenteel voor ciliogenese 14,15. Er is nu erkend familie van menselijke genetische afwijkingen, bekend alsde ciliopathieën, die trilharen functie beïnvloeden en resulteren in CKD 16.
Het groeiend aantal menselijke genetische ziekten van ciliaire ontwikkeling en functie is het tekenen van de wereldwijde belangstelling voor deze ooit beschouwd als rudimentair organel. De cilium, een haar-achtige cellulaire uitsteeksel, is verrijkt met receptoren en ionkanalen die noodzakelijk zijn voor de transductie van belangrijke cel signalering evenementen. De cilium bestaat uit een microtubulus gebaseerde axoneme, gewoonlijk gestructureerd in negen radiaal microtubuli doubletten met of zonder centrale paar singlet microtubuli. De axonemal structuur bepaalt het type en de wijze van ciliaire actie. De 9 + 2 microtubule regeling verleent motiliteit het cilium waar het wordt gebruikt bij de beweging van vloeistoffen in epitheliale oppervlakken. De 9 + 0 configuratie is niet beweeglijk maar wordt dat voornamelijk functie in cellulaire signaleringsgebeurtenissen 17. Afgezien van CKD, de gevolgen van ciliaire dysfunctie zijn een set van karakteristiekeciliopathie functies, waaronder, obesitas, retinale degeneratie, polydactylie, en cognitieve stoornissen 16. Echter, CKD is een van de meest schadelijk voor de kwaliteit van leven van de patiënt en dus een belangrijke drijvende kracht achter de ontwikkeling van geschikte in vivo modellen voor ciliaire gerelateerde CKD.
De zebravis is een uitstekend model om de etiologie van de menselijke genetische ziekte te begrijpen. De snelle ontwikkeling, productie van grote aantal eieren, transparante weefsel en ex utero groei laat zebravis ontwikkelingsprocessen worden gevisualiseerd en biologische gebeurtenissen gemanipuleerd met veel gemak. Genen kunnen genetisch worden veranderd met behulp van het recente succes van genoom bewerkingsgereedschappen (CRISPR 18 en TALENS 19), neergeslagen met morfolino antisense technologie 20 of farmacologisch gereguleerd door de toevoeging van verbindingen aan hun aquatisch milieu. Inderdaad, zebravis een platform bieden om te ondernemen experiments die niet tolerant andere diermodellen. Terwijl zebravissen relatief eenvoudig vertebraten (vergeleken mens) zij hebben veel functioneel geconserveerde organen, genen en signaalprocessen gemeen met de mens. Bijvoorbeeld, de zebravis nier opmerkelijk vergelijkbaar in structuur en functie vergeleken mens 21,22. In tegenstelling tot de zoogdieren nier die ontstaat door een opeenvolging van fasen, elk gekenmerkt door een verder ontwikkelde nier (pronephros, mesonephros en metanefros), de embryonale zebravis ontwikkelt slechts pronephros, de onrijpe vorm van een nier. Terwijl miljoen nefronen te vinden die de bouwstenen van het zoogdier nier, alleen de zebravis embryo bezitten twee. De glomeruli, waardoor de oorspronkelijke bloed filtraat, gefuseerd aan de middellijn alleen ventraal van de aorta. Bloedfilters door de glomeruli in de pronephric buisjes die caudaal lopen langs de as, fusing voorafgaand aan te sluiten via de cloaca. De pronephric tubules zijn zwaar trilharen met beweeglijke trilharen die tolerante om de stroom van het filtraat aan de staartzijde afslag 3,4 zijn. Deze eenvoudige pronephric structuur handhaaft zebravis homeostase door verscheidene weken van larvale groei waar ze uiteindelijk ontwikkelen tot een meer complexe mesonephros structuur 21. De zebravis ontwikkelt nooit metanefros 21. Ondanks de zebravis eigenaardigheden, wordt de zebravis nefron gesegmenteerd met gen-expressie profielen gelijk aan die waargenomen bij zoogdieren en biedt daarmee een ongeëvenaarde in vivo model voor nefrogenese 3,22.
Routinematig patiënten worden getest op nierfunctie door een reeks van bloed en urine testen. Gewoonlijk wordt het bloed geanalyseerd op opgeloste zouten, ureum en creatinine. Hoge ureum, creatinine en abnormale zoutconcentraties zijn indicatief voor problemen nierfunctie. Urineonderzoek met behulp van een colorimetrische peilstok abnormale niveaus van eiwit, Bloo detecteertd, pus, bacteriën en suiker aanwezig in urinemonsters. Dergelijke tests normaliter ongeveer 30 ml urine of 5-10 ml bloed. Het is moeilijk om dit soort assays vertalen naar kleine in vivo modelorganismen, zoals de zebravis, vooral vanwege de onmogelijke aard verzamelen voldoende bloed of urine verrichten van de bepaling. Hier richten we ons op het ontbreken van passende zebravis nierfunctie tests en beschrijven een innovatieve techniek voor zijn studie. Door het injecteren van een fluorescente kleurstof in de bloedstroom we kunnen controleren en afzonderlijk kwantificeren tijd filtratie en uitscheiding van fluorescente activiteit van het bloed via de nieren. Deze methode kan worden gebruikt voor nierbeschadiging gevolge van ziekte, waarvoor wij een voorbeeld bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebravis een kwaliteit in de modellering van menselijke genetische ziekten, hun gebruik als een wetenschappelijk instrument voor in vivo onderzoek gedetailleerde studies van de genetische analyse van vele biologische systemen, waaronder de nieren ingeschakeld. Veel wordt nu begrepen over hoe de zebravis nier ontwikkelt en functies. De opvallende gelijkenissen voor de menselijke nefrogenese en homologie met ziektegenen 21 is duidelijk geworden dat de zebravis zijn fundamentele geworden in het begrijpe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Technische assistentie door Jaipreet Bharj. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de EU-FP7 (SYSCILIA -241.955) en De Nederlandse Nierstichting (CP11.18).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller | Intracel | P-97 | |
| borosilicate standard wall capillaries | Harvard Apparatus | 30-0017 | |
| Glass microscope slides | VWR International | 631-0109 | |
| Epoxy Resin Glue | Evo-Stik | ||
| Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran | Life technologies | D-1824 | |
| N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| air compressor | Jun-Air | OF302-15 | |
| Picospritzer III | Parker Instruments | 051-0500-900 | |
| compact 3-axis control micromanipulator | Marzhauser | MM33 | |
| Dissecting stereo microscope | Nikon | SMZ1000 | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Dumont #5 forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| stage micrometer | Pyser- SGI | 02A00404 |
Referências
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).
- Drummond, I. Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes. Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).
- Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genet. 3 (1), e18 (2007).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Cardenas-Rodriguez, M., et al. Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome. Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).
- Osborn, D. P., et al. Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies. PLoS One. 9 (2), e87662 (2014).
- Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1. J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).
- Tobin, J. L., Beales, P. L. Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies. Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).
- Torres, V. E., Harris, P. C. Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years. Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).
- Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. Autosomal dominant polycystic kidney disease – clinical and genetic aspects. Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).
- Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect. J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).
- Reynolds, D. M., et al. Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease. J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).
- Pazour, G. J., San Agustin, a. j. t., Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease. Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).
- Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia. J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).
- Baker, K., Beales, P. L. Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).
- Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease. Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don’t stop making antisense. Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio). , (2000).
- Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome). Eur J Hum Genet. 21 (1), 8-13 (2013).
- Corbetta, S., et al. High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism. J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).
- Veleri, S., et al. Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects. PLoS One. 7 (3), e34389 (2012).
- Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. . The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease. , (2003).
- Chang, R. L., et al. Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran. Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).
