הערכה של תפקוד כליה דג הזברה באמצעות assay עמילות פלורסנט
Summary
דג הזברה הוא כלי פופולרי למודל מחלת כליות כרונית (CKD). עם זאת, גודלם הקטן עושה את זה בלתי אפשרי להעריך תפקוד הכלייתי בשיטות מסורתיות. אנו מתארים assay אישור כליות צבע ניאון 1 המאפשר ניתוח כמותי של תפקוד כליות דג הזברה בCKD.
Abstract
עובר דג הזברה מציע מודל צייתן ללמוד organogenesis ומודל מחלה גנטית אנושית. למרות פשטותו היחסית, בכליות דג הזברה מתפתחות ופונקציות כמעט באותה הצורה כמו בני אדם. הבדל עיקרי בבנייה של הכליה האנושית הוא נוכחותם של מיליונים nephrons בהשוואה לדג הזברה שיש רק שניים. עם זאת, פישוט מערכת כה מורכבת ליחידות פונקציונליות בסיסיות סייע ההבנה של איך כליות מפתחת ומפעילות. בדג הזברה, קו האמצע ממוקם glomerulus אחראי על סינון הדם הראשוני לשתי צינוריות pronephric שלסטות לרוץ בילטרלי במורד הציר העוברי לפני שהוא נדבק זה לזה בביב. Tubules pronephric מאוכלסים בכבדות על ידי cilia ניעתי שיקל על התנועה של תסנין לאורך אבובית מפולחת, המאפשר החלפה של מומסים שונים עד שלבסוף יציאה באמצעות 2-4 הביב. גנים רבים אחראים למחלת כליות כרונית, including אלה הקשורים לciliogenesis, נחקרו בדג הזברה 5. עם זאת, תיקו גדול בחזרה היה הקושי בהערכת תפקוד כליות דג הזברה לאחר מניפולציה גנטית. מבחני מסורתיים למדידת הפרעות בתפקוד כליות בבני האדם הוכיחו translational לא לדג זברה, בעיקר בשל הסביבה המימית שלהם וגודל קטן. לדוגמא, זה לא אפשרי מבחינה פיזית כדי לחלץ דם עוברי ממבוימים דגים לניתוח של תוכן אוריאה וקריאטינין, כפי שהם קטנים מדי. בנוסף, דג הזברה אינה מייצר מספיק שתן לבדיקה על 'המדיד' פרוטאינוריה פשוטה, המבוצע לעתים קרובות במהלך בדיקות ראשוניות מטופל. אנו מתארים assay ניאון שמנצל את השקיפות האופטית של דג הזברה כדי לפקח כמותית האישור של צבע ניאון, לאורך זמן, מכלי הדם והחוצה דרך הכליות, לתת קריאה מתוך תפקוד הכלייתי 1,6-9.
Introduction
הכליה האנושית משחקת תפקיד מכריע בסינון פסולת המטבולית מן הדם ומתאושש מומסים נדרשים כדי לקיים הומאוסטזיס הסלולר. ישנם מספר מחלות גנטיות אנושיות הגורמות להפרעות בתפקוד כליות. מחלת הכליות התורשתית הנפוצה ביותר היא מחלה אוטוזומלית דומיננטית בכליות פוליציסטיות (ADPKD) מאופיינת בהתפתחות של שלפוחיות נוזל מילא בתוך צינוריות נפריטית; הנזק שנגרם על ידי cystogenesis הוא מזיק לכליות פונקציה 10. יש ADPKD התרחשות של 1: 800 – 1: 1000 ומהווה 8-10% מהחולים באי ספיקת כליות סופנית (ESRF) 11. מספר גנים היו מעורבים לגרום ADPKD כולל polycystin-1 (PKD1) ו-2 (PKD2), המהווים כ 85% ו- 15% מהמקרים, בהתאמה 12,13. יתר על כן, מוצרי הגן לPKD1 ו-2 למקם את cilium והם יסוד לciliogenesis 14,15. יש עכשיו משפחה מוכרת של הפרעות גנטיות אנושיות, הידוע בשםciliopathies, המשפיע על פעילות cilia ולגרום למחלת כליות כרונית 16.
המספר הולך וגדל של מחלות גנטיות אנושיות המשפיעות על התפתחות ותפקוד הריסים הוא ציור העניין העולמי באברון שריד שנחשב בעבר זה. Cilium, בליטה סלולרית דמוי שיער, מועשרת בקולטנים ותעלות יונים הכרחיים לתמרה של אירועי תא איתות מפתח. Cilium מורכב מaxoneme מבוסס microtubule, מובנה בדרך כלל לתשע כפילויות microtubule מסודרות רדיאלית עם או בלי זוג microtubules הגופייה מרכזי. מבנה axonemal מגדיר את הסוג ואופן פעולה הריסים. הסדר microtubule 9 + 2 מעניק תנועתיות לcilium שבו הוא ניצל בתנועה של נוזלים על פני משטחי אפיתל. תצורת 9 + 0 היא הניעה שאינה אלא הוא האמינה בעיקר פונקציה באירועי איתות תאית 17. מלבד CKD, את ההשלכות של חוסר תפקוד הריסים הן קבוצה של מאפייןתכונות ciliopathy הכוללות, השמנת יתר, ניוון רשתית, פולידקטיליה, ופגיעה קוגניטיבית 16. עם זאת, CKD הוא בין המזיקה ביותר לאיכות חיים של החולה ולכן כוח מניע מרכזי מאחורי הפיתוח של דגמים מתאימים בvivo לCKD הריסים קשורים.
דג הזברה הוא מודל מצוין להבין את האטיולוגיה של מחלה גנטית אנושית. הפיתוח מהיר שלהם, ייצור של מספר הגדול של ביצים, רקמה שקופה, וצמיחה ברחם לשעבר מאפשר תהליכי התפתחות דג הזברה להיות דמיינו ואירועים ביולוגיים מניפולציות בקלות רבה. גנים ניתן לשנות גנטי באמצעות ההצלחה האחרונה של כלים לעריכת הגנום (CRISPR 18 וTALENS 19), הפילו את השימוש בטכנולוגית morpholino antisense 20, או מוסדרים פרמקולוגית על ידי התוספת של תרכובות לסביבה המימית שלהם. ואכן, דג הזברה להציע פלטפורמה למתחייבת דוארxperiments שאינם מתירנית במודלים של בעלי חיים אחרים. בעוד דג הזברה הם בעלי חוליות פשוטות יחסית (בהשוואה לבני אדם) הם חולקים איברים רבים נשמרים פונקציונלי, גנים, ותהליכי איתות במשותף עם בני אדם. לדוגמא, בכליות דג הזברה היא דומות להפליא במבנה ותפקוד בהשוואה לבני האדם 21,22. עם זאת, בניגוד לכליות היונקים שמתפתחת דרך רצף של שלבים, כל אחד מסומן על ידי כליות מפותחות יותר (כִּליַת רֵאשִׁית, כליה בינים, וmetanephros), דג הזברה העוברית מתפתחת רק כִּליַת רֵאשִׁית, בצורה לא בוגרת ביותר של כליות. בעוד ניתן למצוא מיליוני nephrons להרכיב את אבני הבניין של הכליות היונקים, עובר דג הזברה יש רק שניים. Glomeruli, המאפשרת לתסנין הדם הראשוני, הם התמזגו בקו האמצע רק הגחון לאב העורקים. מסנני דם דרך glomeruli לtubules pronephric הפועלים caudally לאורך הציר, פיוזינג לפני היציאה דרך הביב. Tu pronephricbules הם ריסי בכבדות עם cilia ניעתי, כי הם מתירנית לזרימה של תסנין לכיוון יציאת הזנב 3,4. מבנה pronephric פשוט זו שומר על הומאוסטזיס דג הזברה דרך מספר שבועות של צמיחת זחל שבו הם לפתח סופו של דבר למבנה כליה בינים מורכב יותר 21. עם זאת, מעולם לא דג הזברה מתפתחת metanephros 21. למרות מוזרויות דג הזברה, נפרון דג הזברה הוא מקוטע עם פרופילי ביטוי גנים שווים לזה שנצפה ביונקים ובכך מציע ללא תחרות במודל vivo לnephrogenesis 3,22.
באופן שיגרתי בחולים, נבחנו צורך בתפקוד כליות באמצעות סדרה של בדיקות דם ושתן. בדרך כלל הדם מנותח למומס מלחים, אוריאה וקריאטינין. רמות גבוהות של אוריאה, קריאטינין וריכוזי מלח חריגים מעידות על בעיות בתפקוד כליות. בדיקת שתן באמצעות מדיד colorimetric מזהה רמות חריגות של החלבון, blooד, מוגלה, חיידקים והווה סוכר בדגימות שתן. בדיקות כאלה בדרך כלל דורשים כ 30 מיליליטר של שתן או 5 – 10 מיליליטר של דם. זה כבר קשה לתרגם סוגים אלה של מבחני לקטנים באורגניזמים מודל vivo, כגון דג הזברה, בעיקר בשל האופי הבלתי אפשרי של איסוף דם או שתן מספיק כדי לבצע את assay. כאן, אנו מתייחסים לחוסר בדיקות פונקציה מתאימות דג הזברה כליות ולתאר טכניקה חדשנית למחקר שלה. על ידי הזרקת צבע פלואורסצנטי לתוך זרם הדם אנו יכולים לפקח ובנפרד לכמת לאורך זמן הסינון והפרשה של פעילות ניאון מהדם דרך הכליות. שיטה זו יכולה לשמש כדי לחקור נזק לכליות הנגרמות על ידי מחלה, שאנו מספקים דוגמה ל.
Protocol
Representative Results
Discussion
דג הזברה להציע כלי רב ערך למודל מחלה גנטית אנושית, השימוש בם כמכשיר מדעי לin vivo מחקר איפשר מחקרים מפורטים של ההתפלגות הגנטית של רבים מערכות ביולוגיות, כוללים הכליות. הרבה עכשיו הבין על איך כליות דג הזברה מתפתחות ופונקציות. הדמיון הבולט לnephrogenesis והומולוגיה עם גנים …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
סיוע טכני המסופק על ידי Jaipreet Bharj. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהאיחוד האירופי-FP7 (SYSCILIA -241,955) והכליות הולנדי הקרן (CP11.18).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller | Intracel | P-97 | |
| borosilicate standard wall capillaries | Harvard Apparatus | 30-0017 | |
| Glass microscope slides | VWR International | 631-0109 | |
| Epoxy Resin Glue | Evo-Stik | ||
| Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran | Life technologies | D-1824 | |
| N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| air compressor | Jun-Air | OF302-15 | |
| Picospritzer III | Parker Instruments | 051-0500-900 | |
| compact 3-axis control micromanipulator | Marzhauser | MM33 | |
| Dissecting stereo microscope | Nikon | SMZ1000 | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Dumont #5 forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| stage micrometer | Pyser- SGI | 02A00404 |
Referências
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).
- Drummond, I. Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes. Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).
- Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genet. 3 (1), e18 (2007).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Cardenas-Rodriguez, M., et al. Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome. Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).
- Osborn, D. P., et al. Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies. PLoS One. 9 (2), e87662 (2014).
- Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1. J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).
- Tobin, J. L., Beales, P. L. Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies. Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).
- Torres, V. E., Harris, P. C. Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years. Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).
- Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. Autosomal dominant polycystic kidney disease – clinical and genetic aspects. Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).
- Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect. J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).
- Reynolds, D. M., et al. Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease. J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).
- Pazour, G. J., San Agustin, a. j. t., Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease. Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).
- Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia. J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).
- Baker, K., Beales, P. L. Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).
- Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease. Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don’t stop making antisense. Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio). , (2000).
- Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome). Eur J Hum Genet. 21 (1), 8-13 (2013).
- Corbetta, S., et al. High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism. J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).
- Veleri, S., et al. Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects. PLoS One. 7 (3), e34389 (2012).
- Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. . The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease. , (2003).
- Chang, R. L., et al. Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran. Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).
