피하 종양 모델에서 종양 침투 백혈구 하위 집합의 평가
Summary
This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.
Abstract
종양 미세 환경에 침투 특수 면역 세포는 종양의 성장 및 생존을 조절한다. 악성 세포는 회피 또는 생존하고 번영하기 위해 항 종양 면역 반응을 파괴해야합니다. 종양 tolerogenic DC 모집, 면역 조절 T 세포 (Tregs), 및 세포 독성 항암 반응을 억제하는 골수 유래 억제 세포 (MDSC)를 포함한 면역 상이한 메커니즘 번호 "탈출"활용. 종양 억제에 참여할 수있는 모든 면역 자극 수지상 세포, 선천성 항 종양 면역 항구 자연 살해 세포 및 세포 독성 T 세포 : 반대로, 항암 효과기 면역 세포는 악성 종양 성장 및 팽창을 늦출 수있다. 프로와 항 종양 백혈구 사이의 균형은 궁극적으로 행동과 형질 전환 된 세포의 운명을 결정한다 인간의 임상 연구의 군중이를 부담했다. 백혈구 하위 집합 따라서, 상세한 분석 내종양 미세 환경은 점점 더 중요 해지고있다. 여기서 우리는 마우스 종양 모델에서 종양 미세 환경에 존재하는 백혈구 침투하는 서브 세트를 분석하기위한 방법을 설명한다. B16 마우스 흑색 종 종양 세포는 C57BL / 6 마우스에서 피하 접종 하였다. 지정된 시간에, 종양 주위의 피부는 일괄하여 절제 한 후 유동 세포 계측법 멀티 색상 염색 단일 세포 현탁액으로 처리됩니다. 백혈구 집합 마커의 다양한 사용하여, 우리는 제어 및 chemerin 발현 종양 사이의 백혈구 하위 집합을 침투의 상대적 비율을 비교할 수 있었다. 연구자들은 면역 종양 미세 환경에 존재하고 종양 성장의 전통적인 캘리퍼 크기 측정과 결합 될 때, 잠재적으로 그것들이 종양 성장에 면역 조성의 변화에 미치는 영향을 규명 할 수 공부 이러한 도구를 사용할 수있다. 이러한 기술은 모든 종양 모델에 적용 할 수있는 종양 미세 환경과의 C이 절제되고 처리 될 수있다.
Introduction
종양의 성장 및 홍보 및 회귀 사이의 균형은, 부분적으로 미세 1, 2에 존재하는 프로와 항 종양 침투 백혈구의 균형에 따라 달라집니다. (TME)를 종양 미세 환경을 연구 구체적 침투성 백혈구 아 집단을 식별하기 위해, 우리는 쥐 종양 모델에서 피하 종양의 평가 방법을 개발 하였다. 종양 미세 환경 연구의 중요성은 잘 알려져 있으며, 문헌에지지된다. 많은 연구 프로 및 항 종양 면역 세포 침윤의 밸런스가 마우스에서뿐만 아니라, (3,4-에서 검토) 인간 결합 연구뿐만 아니라, 종양 성장의 결과에 영향을 미칠 수 있음을 보여 주었다. 예를 들어, Curiel 등은. 난소 암 환자의 임상 결과는 종양 침윤 규제 CD4 + T 세포 (Tregs) (5)의 비율을 증가의 존재와 상관 관계가 있었다 악화 것으로 나타났다. 우리 자신의 작품 또한 아무런 효과를 보여 주었다또한, 상관 관계를 마우스 흑색 종 모델 6에 백혈구 아형의 비율 VEL 백혈구 화학 유인 물질은 종양 성장을 감소시켰다. 따라서, 종양 내의 백혈구의 서브 세트 상세한 분석은 더욱 광범위하게 인식되고 점차 중요.
백혈구 침투에 대한 종양 미세 환경을 평가하는 방법에는 여러 가지가 있습니다; 능력에 일부 – 예를 들어 그룹은 이미지 TME 7, 고전 면역 조직 화학 및 MRI, PET, 공 초점 현미경 9-11 등 다양한 이미징을 포함하여 보존 섹션 8의 면역을 위해 다양한 형광 단백질을 표현하는 유전자 변형 쥐를 설계했다 intravitally (10, 12) 모니터링 할 수 있습니다. 이러한 나노 입자 (13)이나 신규 한 조영제 면역 세포에 라벨 (14) 등의 각종 분자 조영제로 사용될 수있다. 우리의 방법은 유동 세포 계측법 기반 접근법이며, 몇 가지 장점을 갖는다.우선, 전체 종양 미세 환경이 샘플링 될 수있다; 분석시에, 전체 주변 피하 종양 주변부 절제 수술로 처리된다. 이는 단일 종양 내의 잠재적 샘플링 바이어스를 제거하고, 전체적으로 더 많은 종양 "글로벌"분석을 제공한다. 둘째, 백혈구 서브 세트를 분석하는 다색 유동 세포 계측법을 사용하여보다 구체적으로 침윤하는 백혈구의 표현형을 측정 할 수있게 해준다. 사용 된 색의 개수에 따라, 매우 특정한 서브 세트가 식별 될 수있다. 심지어 일반적인 서브 타입 분류 – – 종양의 운명을 결정하는데 잠재적으로 중요한 의미를 다른 기능을 갖는 여러 특정 백혈구 세포 유형 내에서 서브 세트가 있기 때문에 중요하다. 예를 들어, 형질 수지상 세포 (PDC)은 항 종양 면역 (15)에 연루되어있다. 그러나, PDCS의 CCR9 + 서브 세트 tolerogenic 16로 도시 한 BA를 이동 한이러한 서브 세트의 랜스는 종양 성장에 영향을 미칠 수있다.
우리의 방법은 피하 또는 일괄하여 절제 할 수있는 다른 종양에 적절하고 있습니다. 우리의 손에, 종양 균일 안락사시 절제 하였다. 일부 연구에서 수행 된 바와 그러나 피하 종양이 완전히 따라서 동물의 추가 평가를 허용 생존 수술 (17)에서 주변의 피부 절제하여 고정 될 수 있음을, 생각할 수있다. 분석 후, 절제된 종양에 대해 수행된다. 따라서, 상기 결과는 종양의 발달에 단일 평가시기를 나타낸다. 이 미세 환경에 대한 자세한 모습을 수 있지만, 그것은 또한 의심의 여지 역동적 인 과정이 무엇인지의 정적 사진입니다. 그러나, 절연 백혈구 (예를 통해 자기 분리 또는 밀도 구배) previ 한 이래로 후, 종양 상피 및 간질 별도로 분석, 또는 상기 표현형을 정의하는 다른 기능 분석에 사용될 수있다ously 18을 설명했다. 이 방법은, 그 후, 자연 투병 기간의 설정에서, 또는 특정한 치료 학적 섭동 후인지, 소정의 시점에서 종양 미세 환경 내의 백혈구의 조성을 이해에 관심이있는 연구자에 유용 할 것이다. 우리가 수행되어 있지 않지만,이 절차의 변형, 잠재적으로 격리에서 종양의 특정 부분을 분석하는데 사용될 수있다. 예를 들면, 종양의 크기가 주어진 주변부 구역 (들)은 연구자에게 종양 미세 환경의 공간적 분리 더 파악할 수 있도록 거리의 중앙 종양, 괴사 가능성 코어 해부 될 수있다.
종양 면역학의 급성장 필드에 의심의 여지가 생쥐 종양 모델에서 새로운 면역 조절제를 평가하는 연구의 기하 급수적으로 증가 수 없을 것이다. 몇몇 보고서 주연 EN 대 종양 내의 특정 백혈구 기능의 차이를 강조vironment. 예를 들어, 쉐이퍼 – 버 외는.들은 종양 미세 환경 (19)에 트래픽이 일단 항원 – 특이 T의 효과기 CD8 + 세포는, 주변부에서 활성 상태, CD8 + T 억제 세포로 형질 전환 된 마우스 모델에서 나타났다. 이 TGFβ에 의한 부분이었다, 그러나 다른 요인은 가능성뿐만 아니라 참여하고 있습니다. 따라서, 백혈구 아형 평가 – 숫자 및 비율뿐만 아니라 기능적 상태 – 종양 자체 내 것은 종양 운명에 특정 면역의 효과에 대한보다 정확한 표현을 제공한다.
우리의 방법은 종양의 상세한 분석이 가능하고 연구원 더욱 가깝게 접근 이전보다 백혈구 개체수의 변화를 식별 할 수있는 기회를 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
종양 미세 환경의 상세한 분석을 수행하는 메커니즘과 면역의 효과를 결정하는데 중요하다. 종양 침투 백혈구에 이러한 에이전트의 영향을 이해하는 인간의 임상 영역에서 immunotherapeutics의 증가 존재와 그들의 작용 메커니즘을 정의하는 필수가되고있다. 인간에서 종종 이와 주연 면역 반응의 분석을 획득하고 백혈구 서브셋 분석 종양 조직을 분석 및 임상 및 / 또는 로지스틱 어려움이 존재는 종…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 보조금 R01-CA169354에 의해 지원되었다 및 R01-047822 국립 보건원 (National Institutes of Health)과 보훈 (ECB)에서 우수상에서. RKP는 NIH T32 CA009287-30A1, ASCO 젊은 연구자 상, 캘리포니아 유방암 연구 프로젝트 원정대, 그리고 미국 암 협회 (American Cancer Society) 가르 연구 학술 그랜트에 의해 지원되었다; BAZ는 NIH 보조금 AI079320에 의해 지원되었다. JM은 NIH T-32 훈련 보조금 T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 및 미국 암 학회 (American Cancer Society) 박사후 PF-12-052-01-CSM에서 연구비에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; keep on ice |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 micron filter | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
| 5 ml syringe | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| surgical scissors/forceps | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; keep on ice |
| trypan blue | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| hemacytometer | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| Live/Dead stain | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| FlowJo software | TreeStar, Inc | flowjo.com |
Referências
- Mantovani, A., et al. Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat Rev Immunol. 6 (10), 715-727 (2006).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
- Pachynski, R. K., et al. The chemoattractant chemerin suppresses melanoma by recruiting natural killer cell antitumor defenses. J Exp Med. 209 (8), 1427-1435 (2012).
- Hoffman, R. M. Transgenic nude mice ubiquitously expressing fluorescent proteins for color-coded imaging of the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 1194, 353-365 (2014).
- Mansfield, J. R. Imaging in cancer immunology:phenotyping immune cell subsets in situ in FFPE tissue sections. MLO Med Lab Obs. 46 (6), 12-13 (2014).
- Serres, S., O’Brien, E. R., Sibson, N. R. Imaging angiogenesis, inflammation, and metastasis in the tumor microenvironment with magnetic resonance imaging. Adv Exp Med Biol. 772, 263-283 (2014).
- Schietinger, A., et al. Longitudinal confocal microscopy imaging of solid tumor destruction following adoptive T cell transfer. Oncoimmunology. 2 (11), e26677 (2013).
- Singh, A. S., Radu, C. G., Ribas, A. P. E. T. imaging of the immune system: immune monitoring at the whole body level. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54 (3), 281-290 (2010).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
- Habibollahi, P., et al. Fluorescent nanoparticle imaging allows noninvasive evaluation of immune cell modulation in esophageal dysplasia. Mol Imaging. 13 (3), 1-11 (2014).
- Balducci, A., et al. A novel probe for the non-invasive detection of tumor-associated inflammation. Oncoimmunology. 2 (2), e23034 (2013).
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J Clin Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Hadeiba, H., et al. CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease. Nat Immunol. 9 (11), 1253-1260 (2008).
- McLean, M., et al. A BALB/c murine lung alveolar carcinoma used to establish a surgical spontaneous metastasis model. Clin Exp Metastasis. 21 (4), 363-369 (2004).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. J Vis Exp. (64), e3952 (2012).
- Shafer-Weaver, K. A., et al. Cutting Edge: Tumor-specific CD8+ T cells infiltrating prostatic tumors are induced to become suppressor cells. J Immunol. 183 (8), 4848-4852 (2009).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry A. 71 (6), 379-385 (2007).
- Hackstein, H., et al. Heterogeneity of respiratory dendritic cell subsets and lymphocyte populations in inbred mouse strains. Respir Res. 13, 94 (2012).
- Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity. Cancer Immunol Immunother. 59 (10), 1593-1600 (2010).
- Curran, M. A., Montalvo, W., Yagita, H., Allison, J. P. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4275-4280 (2010).
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity’s roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
