Bir deri altı tümör modelinde tümör-süzücü lökosit subsetleri Değerlendirilmesi
Summary
This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.
Abstract
Tümör mikro sızmak İhtisas bağışıklık hücreleri neoplazi büyümesini ve hayatta kalmasını düzenler. Malign hücreler sıyrılmak veya hayatta ve gelişmek için anti-tümör immün yanıtları yıkmak gerekir. Tümörler tolerojenik DC işe, immunsupresif düzenleyici T hücreleri (Tregs), ve sitotoksik anti-tümör yanıtları inhibe miyeloid türetilmiş baskılayıcı hücreler (MDSC) gibi bağışıklık farklı mekanizmaları bir dizi "kaçış" yararlanmak. Tümör baskılamasında katılabilir bütün immünostimülatör dendritik hücreler, doğal bir anti-tümör bağışıklık liman doğal katil hücreler ve sitotoksik T hücreleri: Bunun aksine, anti-tümör efektör bağışıklık hücreleri habis büyüme ve genişleme yavaşlatabilir. pro- ve anti-tümör lökositlerin arasındaki denge sonuçta davranış ve transforme edilmiş hücrelerin kaderini belirler; insan klinik çalışmalarda çok sayıda bu karşılanır var. Lökosit alt kümelerinin Böylece, detaylı analiz içindetümör mikro giderek daha önemli hale gelmiştir. Burada, bir fare tümör modelinde tümör mikro-ortamında mevcut infiltratif lökosit subsetleri analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Fare B 16 melanoma tümör hücreleri, C57BL / 6 farelerine deri altından aşılandı. Belirli bir zamanda, tümörler ve çevredeki cilt blok halinde çıkarıldı ve daha sonra akış sitometrisi çok renkli boyandı tek hücre süspansiyonları içine işlenir. Lökosit alt kümesi belirteçleri çeşitli kullanarak, kontrol ve chemerin-ifade tümörler arasında lökosit alt kümelerini infiltre göreli yüzdelerini karşılaştırmak başardık. Araştırmacılar, bağışıklık tümörün mikro-ortamı varlığı ve tümör büyümesinin geleneksel kalınlığı boyutu ölçümleri ile bir araya getirildiğinde, potansiyel olarak bunları, tümör büyümesi üzerinde immün bileşim içinde değişikliklerin etkisini açıklamak sağlayacak çalışma için böyle bir araç kullanılabilir. Böyle bir teknik, herhangi bir tümör modeli tatbik edilebilir olduğu tümör ve mikro-ortam CBir rezeke ve işlenebilir.
Introduction
tümör büyümesi ve teşvik ve regresyon arasındaki denge, kısmen, mikro-1,2 bulunan pro- ve anti-tümör infiltre eden lökositlerin dengesine bağlıdır. (TME) tümör mikro çalışma ve özellikle infiltratif lökosit alt-popülasyonunu tespit etmek amacıyla, bir fare tümör modelinde deri altı tümörleri değerlendirilmesi için bir yöntem geliştirdi. tümör mikro okuyan önemi de bilinen ve literatürde desteklenmemektedir. Çok sayıda çalışma, pro- ve anti-tümör infiltre eden bağışıklık hücrelerinin dengesini farede değil, aynı zamanda (3,4 gözden) insan üzerinde çalışmalar sadece tümör büyüme sonuçlarını etkileyebilir göstermiştir. Örneğin, Curiel ve diğ., Yumurtalık kanseri hastalarında klinik sonuçlar, tümör-süzücü düzenleyici CD4 + T hücreleri (Tregs) 5 oranları artırmak varlığı ile korelasyon kötüleştiğini göstermiştir. Kendi çalışmaları da bir hiçbir yerde etkisini gösterdiAyrıca korelasyon fare melanom modelinde 6, lökosit alt grupları oranına vel lökosit kemoatraktan tümör büyümesini azalmıştır. Böylece, bir tümör içindeki lökosit alt gruplarının detaylı analizler artık daha geniş tanınır ve giderek daha önemli.
Lökositler infiltratif tümör mikroçevresinin değerlendirmek için birçok yolu vardır; yeteneği ile bazı – örneğin gruplar görüntünün TME 7, klasik immünohistokimyasal ve MR, PET, konfokal mikroskopi 9-11 gibi çeşitli görüntüleme yöntemleri de dahil olmak üzere korunmuş bölümlerin 8, immünofloresan amacıyla çeşitli floresan proteinleri ifade transgenik fareler tasarladık intravitally 10,12 monitör. Bu tür nano partiküller 13 veya yeni kontrast maddeler, bağışıklık hücreleri etiketlemek 14 gibi çeşitli moleküler görüntüleme maddeleri ile birlikte de kullanılabilir. Önerilen yöntem, bir akış sitometrisi dayalı bir yaklaşım ve birçok avantajı vardır.İlk olarak, tüm tümör mikro örnek olabilir; analiz sırasında, tüm deri altı tümör ve çevresindeki çevre cerrahi işlem için rezeke edilir. Bu, tek bir tümör içinde herhangi bir potansiyel örnekleme yanlılığı ortadan kaldırır ve bir bütün olarak tümörün bir daha "küresel" analizi verir. İkincisi, lökosit alt kümelerini analiz etmek sitometri renkli akışını kullanarak daha özel infiltre lökositlerin fenotip ölçmek için bize izin verir. Renklerin sayısına bağlı olarak, çok özel alt-gruplar belirlenebilir. Hatta genel alt tipi sınıflandırma – – tümör kaderini belirlemede potansiyel olarak önemli olan farklı işlevlere sahip birkaç lökosit belirli bir hücre türü içinde alt kümeleri olarak orada bu önemlidir. Örneğin, plazmasitoid dendritik hücreler (PDC) anti-tümör bağışıklık 15 implike edilmiştir. Ancak, pDC'lerde ve CCR9 + alt kümesi tolerojenik 16 olduğu gösterilmiştir, ve ba değişen olmuşturBöyle bir alt kümesi mızrak tümör büyümesi üzerinde bir etkisi olabilir.
Bizim yöntem subkutan veya en blok rezeksiyon edilebilecek diğer tümörler için uygundur. Bizim ellerde, tümörler eşit ötenazi sırasında rezeke edildi. Bazı çalışmalarda yapılmıştır Ancak, bu, deri altı tümör tam böylece hayvan ek olarak değerlendirilmesine imkan veren, bir hayatta kalma cerrahi 17 çevreleyen derinin kapatılması ile çıkarıldı olabilir ki, düşünülebilir. Analize daha sonra kesilen tümörün gerçekleştirilir. Böylece, sonuç tümörün gelişiminde tek bir zaman noktası temsil eder. Bu mikro içine ayrıntılı bir görünüm sağlar, aynı zamanda şüphesiz dinamik bir süreçtir ne statik resim. Bununla birlikte, izole edilmiş bir lökosit (örneğin bir manyetik ayırma veya yoğunluk gradyanı) PREVI olduğu gibi, daha sonra tümör epitel ve stromadan ayrı ayrı analiz, ya da daha da fenotipi belirlemek için diğer işlevsel tahlillerde kullanılabilirously 18 tanımladı. Bu yöntem, daha sonra, doğal hastalık tabii ortamda veya belirli bir terapötik bozulduktan sonra olsun, belirli bir zaman noktasında tümörün mikro olan lökositlerin bileşimin anlamaya yönelik bir araştırmacı için yararlı olacaktır. Tarafımızdan yapılan olmasa da, bu prosedürün varyasyonları da potansiyel olarak izole bir tümör spesifik kısımları analiz etmek için kullanılabilir. Örneğin, tümörün büyüklüğü göz önüne alındığında, periferik zon (ler) araştırmacıya tümör mikro bir daha uzamsal ayrılmış bir görünüm vermek için uzak tümörün merkez, muhtemelen nekrotik çekirdek disseke edilebilir.
Tümör immünoloji alanında gelişen, hiç şüphesiz fare tümör modellerinde yeni bağışıklık maddeleri değerlendiren çalışmaların bir katlanarak artan sayıda olacak. Çeşitli raporlar, periferik tr karşı tümörün içinde belirli lökosit fonksiyon farklılıkları sermiştirçevre ve do¤a. Örneğin, Shafer-Weaver ve ark., Tümör mikro-19 kaçırılan sonra antijene spesifik efektör T CD8 + hücreleri, çevre aktif iken, CD8 + T baskılayıcı hücrelerine transforme edildi, bir fare modelinde saptandı. Bu TGFβ nedeniyle kısmen oldu, ama diğer faktörler muhtemelen de katılıyor. Böylece, lökosit alt kümelerini değerlendirilmesi – sayılar ve oranlar, yanı sıra fonksiyonel durumunu – tümörün kendisi içinde tümör kaderi belirli bir immünomodülasyon etkisinin daha doğru bir temsilini verecek.
Bizim teknik tümörün detaylı analiz sağlar ve araştırmacıya daha yakından önceki yaklaşımlara göre lökosit popülasyonlarının değişiklikleri tanımlamak için bir fırsat sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tümör mikroçevresinin ayrıntılı analizini gerçekleştirme mekanizmaları ve immünomodülasyon etkilerini belirlemede önemlidir. Tümör infiltre lökositler bu ajanların etkisini anlamak insan klinik alanda Immunotherapeutics artan varlığı ile etki mekanizmalarını tanımlarken koşul haline gelmektedir. İnsanlarda, çoğu zaman bu şekilde çevresel bağışıklık tepkisinin analizi elde edilmesi ve lökosit alt-küme analizi için tümör dokusu analiz ve klinik ve / veya lojistik zorlukları da bulunm…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma hibe R01-CA169354 tarafından desteklenen ve R01-047822 Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Gazi İşleri Bakanlığı (ECB) bir Liyakat Ödülü. RKP NIH T32 CA009287-30A1, bir ASCO Genç Araştırmacı Ödülü, Kaliforniya Meme Kanseri Araştırma Projesi Bursu ve bir Amerikan Kanser Derneği Mentored Araştırmacı Grant tarafından desteklenmiştir; BAZ NIH hibe AI079320 tarafından desteklenmiştir. JM NIH T-32 eğitim bursu T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 ve Amerikan Kanser Derneği doktora sonrası burs PF-12-052-01-CSM burs tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; keep on ice |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 micron filter | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
| 5 ml syringe | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| surgical scissors/forceps | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; keep on ice |
| trypan blue | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| hemacytometer | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| Live/Dead stain | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| FlowJo software | TreeStar, Inc | flowjo.com |
Referências
- Mantovani, A., et al. Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat Rev Immunol. 6 (10), 715-727 (2006).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
- Pachynski, R. K., et al. The chemoattractant chemerin suppresses melanoma by recruiting natural killer cell antitumor defenses. J Exp Med. 209 (8), 1427-1435 (2012).
- Hoffman, R. M. Transgenic nude mice ubiquitously expressing fluorescent proteins for color-coded imaging of the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 1194, 353-365 (2014).
- Mansfield, J. R. Imaging in cancer immunology:phenotyping immune cell subsets in situ in FFPE tissue sections. MLO Med Lab Obs. 46 (6), 12-13 (2014).
- Serres, S., O’Brien, E. R., Sibson, N. R. Imaging angiogenesis, inflammation, and metastasis in the tumor microenvironment with magnetic resonance imaging. Adv Exp Med Biol. 772, 263-283 (2014).
- Schietinger, A., et al. Longitudinal confocal microscopy imaging of solid tumor destruction following adoptive T cell transfer. Oncoimmunology. 2 (11), e26677 (2013).
- Singh, A. S., Radu, C. G., Ribas, A. P. E. T. imaging of the immune system: immune monitoring at the whole body level. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54 (3), 281-290 (2010).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
- Habibollahi, P., et al. Fluorescent nanoparticle imaging allows noninvasive evaluation of immune cell modulation in esophageal dysplasia. Mol Imaging. 13 (3), 1-11 (2014).
- Balducci, A., et al. A novel probe for the non-invasive detection of tumor-associated inflammation. Oncoimmunology. 2 (2), e23034 (2013).
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J Clin Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Hadeiba, H., et al. CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease. Nat Immunol. 9 (11), 1253-1260 (2008).
- McLean, M., et al. A BALB/c murine lung alveolar carcinoma used to establish a surgical spontaneous metastasis model. Clin Exp Metastasis. 21 (4), 363-369 (2004).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. J Vis Exp. (64), e3952 (2012).
- Shafer-Weaver, K. A., et al. Cutting Edge: Tumor-specific CD8+ T cells infiltrating prostatic tumors are induced to become suppressor cells. J Immunol. 183 (8), 4848-4852 (2009).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry A. 71 (6), 379-385 (2007).
- Hackstein, H., et al. Heterogeneity of respiratory dendritic cell subsets and lymphocyte populations in inbred mouse strains. Respir Res. 13, 94 (2012).
- Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity. Cancer Immunol Immunother. 59 (10), 1593-1600 (2010).
- Curran, M. A., Montalvo, W., Yagita, H., Allison, J. P. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4275-4280 (2010).
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity’s roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
